一種靈芝酸高產(chǎn)工程菌株kmust-SQS的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種靈芝酸高產(chǎn)工程菌株kmust-SQS，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?NO.9059，本發(fā)明提供的靈芝工程菌，是通過選用靈芝強啟動子P-gpd過表達編碼鯊烯合酶?squalenesynthase(SQS)基因，得到高產(chǎn)靈芝酸靈芝工程菌kmust-SQS；通過搖瓶發(fā)酵實驗表明，該菌在其細胞生長不受影響的情況下，SQS轉(zhuǎn)化子菌株中靈芝酸的含量比野生型菌株(WT菌株)提高了23.8%，其中單體靈芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S分別比WT菌株提高了82.96%，49.84%，174.51%，31.80%，因此，本高產(chǎn)菌株可以作為生產(chǎn)靈芝酸的工程菌株，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】—種靈芝酸高產(chǎn)工程菌株kmust-SQS
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和代謝工程領(lǐng)域的，具體涉及一種通過基因工程對靈芝代謝途徑中有關(guān)靈芝酸合成的鯊烯合酶(SQS)基因過表達的方法，構(gòu)建了一個靈芝酸的高產(chǎn)工程菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]靈芝、Ganoderma Iucidum、是擔子菌綱,多孔菌科,靈芝屬真菌。靈芝真菌在我國有20多種，包括赤芝，黃芝，紫芝，黑芝，薄蓋靈芝，樹舌等。我國應用靈芝作為藥物已有兩千多年的歷史。靈芝對于增強人體免疫力，調(diào)節(jié)血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護肝，促進睡眠等方面均具有顯著療效。由于其特殊的要用價值，靈芝的有效成分分析和藥理學研究已經(jīng)引起了國際上的廣泛關(guān)注，尤其在日本，美國，韓國等國家。目前，靈芝的研究已經(jīng)深入到了分子水平，一些專著相繼出版，從不同的角度介紹了靈芝的生物學特性、栽培技術(shù)、藥理學作用及臨床應用等情況。
[0003]靈芝酸是一類分子結(jié)構(gòu)中含有羧基的三萜類物質(zhì)，從結(jié)構(gòu)來看它屬于高度氧化的羊毛留烷衍生物。自1982年Kubota T等人首次分離得到靈芝酸以來，目前已有130多種靈芝酸被分離出來。它們多為四環(huán)三萜類化合物，含有30個碳原子，結(jié)構(gòu)中一般都有羥基，在IR中有較強的羥基吸收峰。在紫外光譜中也呈現(xiàn)多個波長的特征吸收，多數(shù)是在250 nm、237 nm、365 nm處有吸收峰。靈芝酸具有許多重要的藥理活性如:抗癌，靈芝酸類物質(zhì)能明顯抑制小鼠肝肉瘤(HTC )細胞的增殖；護肝，靈芝中的靈芝酸提取物能加強其解毒作用；抗HIV ;降血壓；抗氧化 ；抑制血小板凝集，抑制組胺釋放，鎮(zhèn)痛，抑制真核細胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶活性和促進體液免疫功能等作用。
[0004]鯊烯合酶(SQS )基因是靈芝酸合成途徑中的一個較為重要的基因。它主要催化法呢酯焦磷酸FPP轉(zhuǎn)化為鯊烯，進而合成靈芝酸。靈芝酸是通過甲羥戊酸途徑合成的。這條途徑普遍存在于動物，植物，真菌。首先是由乙酰輔酶A ( Acetyl CoA )在硫解酶(Acetoacetyl CoA thiolase )催化下縮合形成乙酸乙酸輔酶A ( Acetoacetyl CoA ),乙酸乙酰輔酶A經(jīng)HMG-CoA合成酶(HMG-CoA synthase )催化與另一分子乙酰CoA縮合生成3-輕基-3甲基-戊二酸單酰輔酶A ( HMG-CoA )，然后HMG-CoA還原酶(HMG-CoA reductase,HMGR )催化HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸。甲羥戊酸經(jīng)甲羥戊酸激酶(MVK )、甲羥戊酸5-磷酸激酶(PMK)和MDD三步酶促反應轉(zhuǎn)化為IPP。IPP進一步轉(zhuǎn)化成法呢酯焦磷酸FPP。FPP在S烯合酶squalene synthase ( SQS )的催化下合成S烯SQS后經(jīng)過S烯單加氧酶的作用產(chǎn)生鯊烯2，3-氧化物，再經(jīng)過羊毛留醇合酶(LS)的作用產(chǎn)生羊毛留醇。最后通過不同酶的修飾作用產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的靈芝三萜。靈芝酸的合成途徑如下所示:
【權(quán)利要求】
1.一種靈芝酸高產(chǎn)工程菌株kmust-SQS，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編 號為CGMCC N0.9059。
【文檔編號】C12N15/80GK104017738SQ201410199886
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】徐軍偉, 任夢飛, 周降生, 紀森林, 賀宜龍 申請人:昆明理工大學