一種檢測微生物細胞中脂肪烴的構(gòu)建體及利用構(gòu)建體原位檢測脂肪烴的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程與生物能源領(lǐng)域，具體而言是一種檢測微生物細胞中脂肪烴 的構(gòu)建體及利用構(gòu)建體原位檢測脂肪烴的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)展生物燃料是解決人類所面臨的資源、能源與環(huán)境等方面問題的有效途徑之 一。由于脂肪烴是汽油、柴油、航空煤油等發(fā)動機燃料的主要成分，具有高能量密度、低吸濕 性與低揮發(fā)性，并且與現(xiàn)有運輸設(shè)施及發(fā)動機系統(tǒng)相匹配，生物脂肪烴已經(jīng)被認為是一種 最有潛力的優(yōu)質(zhì)生物燃料。
[0003] 近年來，在生物體中發(fā)現(xiàn)的脂肪烴合成途徑主要有五種，由不同的酶催化完成 (WangW,LuX:MicrobialBiosynthesisofAlka(e)nes.FrontiersinBioengineering andBiotechnology. 2013, 1(10): 1-5)。例如，在藍細菌中主要存在一條兩步法合成脂 肪經(jīng)的途徑，即脂酰ACP(fattyacylacyl-carrierprotein)在脂酰ACP還原酶（acyl acyl-carrierproteinreductase,AAR)作用下生成脂肪酸，脂肪酸再經(jīng)脂肪酸脫甲 酰加氧酶（aldehyde-deformylatingoxygenase,AD0)催化脫甲?；芍窘?jīng)和甲 酸（SchirmerA,RudeMA,LiΧΖ,PopovaΕ,delCardayreSB:MicrobialBiosynthesis ofAlkanes.Science2010, 329(5991) :559-562)。此外，在Jeotgalicoccus菌中存在 一種細胞色素P45001eT，它能夠直接將脂肪酸脫羧基生成具有末端不飽和雙鍵的烯烴 (RudeMA,BaronTS,BrubakerS,AlibhaiM,DelCardayreSB,SchirmerA:Terminal Olefin(1-Alkene)BiosynthesisbyaNovelP450FattyAcidDecarboxylasefrom JeotgalicoccusSpecies.AppliedAndEnvironmentalMicrobiology2011, 77(5):1718-1 727)。目前上述途徑均已實現(xiàn)在大腸桿菌或藍細菌中重組表達，且成功檢測到C15、C17、C19 等脂肪烴的合成，表現(xiàn)出較好的發(fā)展前景。
[0004] 一些具有天然脂肪烴生物合成途徑的微生物合成脂肪烴的效率都很低，并不具 備工業(yè)應(yīng)用潛力。因此，通過生物工程技術(shù)手段在一些具有工業(yè)應(yīng)用潛力的模式微生物 中（如大腸桿菌、酵母、藍細菌等），大幅度提高脂肪烴的生物合成效率是當(dāng)前的研究重點 (KailioP,PasztorA,AkhtarMK,JonesPR:Renewablejetfuel.CurrentOpinionin Biotechnology2014, 26:50-55)，而實現(xiàn)對細胞內(nèi)脂肪烴含量的快速檢測是實施脂肪烴生 物合成途徑工程改造的一個關(guān)鍵性的前提條件。然而，由于細胞內(nèi)脂肪烴含量極低，且通常 難以和其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使得快速檢測細胞中的脂肪烴含量成為極大的難題。目前 最常用也是最主要的脂肪烴檢測方法是有機溶劑抽提結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS)分 析技術(shù)，該方法實驗操作復(fù)雜，流程較長，儀器設(shè)備要求高，無法實現(xiàn)大量樣品的并行分析， 不能夠滿足原位快速與高通量檢測的要求。
[0005] 近年來，環(huán)境微生物學(xué)與合成生物學(xué)的發(fā)展為微量脂肪烴檢測提供了新的可能 手段。在不動桿菌（Acinetobacterbaylyi)、假單胞菌（Pseudomonas)等環(huán)境微生物 中，存在由脂肪烴誘導(dǎo)的信號通路，該信號通路利用環(huán)境中的脂肪烴作為信號分子，誘導(dǎo) 相關(guān)蛋白質(zhì)的表達。通過將某些易于檢測的報告蛋白編碼基因置于該信號通路的下游， 構(gòu)建脂肪烴生物傳感器元件，即可通過檢測由脂肪烴誘導(dǎo)產(chǎn)生的報告蛋白而實現(xiàn)對環(huán) 境中脂肪烴的間接檢測?；谶@一發(fā)現(xiàn)，在含烴廢水的檢測方面已有一些成功的例子， 例如Zhang等（ZhangDY,HeY,WangY,WangH，WuL,AriesE,HuangWE:Whole_cell bacterialbioreporterforactivelysearchingandsensingofalkanesandoil spills.MicrobialBiotechnology2012,5(l):87_97)構(gòu)建的以A.baylyiADP1 為宿 主的AlkR-PalkM: :LuxCDABE烴傳感器，能夠檢測環(huán)境中碳鏈長度12~24的脂肪烴； Sticher等(SticherP,JaspersMCM,StemmierK,HarmsH,ZehnderAJB,vanderMeer JR:Developmentandcharacterizationofawhole-cellbioluminescentsensorfor bioavailablemiddle-chainalkanesincontaminatedgroundwatersamples.Applied andEnvironmentalMicrobiologyl997, 63 (10) :4053-4060)構(gòu)建的以E.coliDH5α為宿 主的AlkS-PalkB: :LuxAB烴傳感器，能夠用于檢測環(huán)境中的微量辛烷（CSH1S)?；谏鲜霭l(fā) 現(xiàn)，可以進一步設(shè)計和構(gòu)建用于檢測細胞內(nèi)脂肪烴含量的生物傳感器元件，即可以通過將 該生物傳感器元件整合進入產(chǎn)烴工程菌，或者說在已整合該生物傳感器元件的工程菌中導(dǎo) 入產(chǎn)烴途徑，從而實現(xiàn)對細胞中合成的脂肪烴的原位快速檢測。目前尚無將這一思路成功 應(yīng)用于細胞內(nèi)生物合成脂肪烴檢測的報道。
[0006] 目前已報道的脂肪烴生物傳感器元件均有各自的局限性，無法實現(xiàn)對細胞中合成 脂肪烴的原位快速檢測。例如，已證明來自不動桿菌ADP1的AlkR-PalkM脂肪烴檢測元件在 大腸桿菌不能夠正常工作（SchirmerA，HuZ，CostaB，USPatent2008/0293060A1)，而能夠 在大腸桿菌工作的AlkS-PalkB元件對于碳鏈長度> 9的中長鏈脂肪烴沒有檢測效果（Reed B,BlazeckJ,AlperH:Evolutionofanalkane-induciblebiosensorforincreased responsivenesstoshort-chainalkanes.JournalofBiotechnology2012, 158(3):75-7 9) 〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服目前對于細胞內(nèi)脂肪烴的現(xiàn)有檢測方法操作復(fù)雜，儀器要求 高的不足，提供一種檢測微生物細胞中脂肪烴的構(gòu)建體及利用構(gòu)建體原位檢測脂肪烴的方 法。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0009] -種檢測微生物細胞中脂肪烴的構(gòu)建體，構(gòu)建體包含至少一個脂肪烴檢測元件和 一個報告蛋白兀件；
[0010] 脂肪烴檢測元件由具有脂肪烴響應(yīng)特性的轉(zhuǎn)錄激活因子和啟動子組成；所述報告 蛋白元件為能夠在宿主中功能性表達和被檢測的蛋白質(zhì)
[0011] 進一步的說，所述構(gòu)建體包含由啟動子Palks、轉(zhuǎn)錄激活因子AlkR和啟動子PalkM 組成的脂肪烴檢測元件；以及以綠色熒光蛋白、LacZ、熒光素酶或抗性基因作為的報告蛋白 元件。
[0012] -種原位快速檢測細胞內(nèi)脂肪烴的方法：利用所述構(gòu)建體將其導(dǎo)入宿主細胞，再 將宿主細胞進行培養(yǎng)并誘導(dǎo)其合成脂肪烴，而后通過檢測報告蛋白的表達，從而實現(xiàn)對細 胞內(nèi)脂肪烴的檢測。
[0013] 進一步的說，所述檢測是將編碼脂肪烴檢測元件與報告蛋白基因的DNA通過聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接入含有抗性基因的表達載體中，將所述表達載體導(dǎo)入含有產(chǎn)烴途徑或潛在 產(chǎn)烴途徑的宿主細胞中；將所述宿主在添加相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并誘導(dǎo)其合成 脂肪烴，繼續(xù)培養(yǎng)而后檢測報告蛋白的表達水平，即檢測到報告蛋白的信號，由此獲得脂肪 烴的含量。所述脂肪烴為中長鏈脂肪烴。所述宿主細胞為大腸桿菌、酵母或