越南槐內(nèi)生真菌trxy-34-1在防治三七炭疽病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1在防治三七 炭疽病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對(duì)植物病害的防治過度依賴于化學(xué)農(nóng)藥的使用，大量化學(xué)農(nóng)藥的施放不 僅對(duì)生態(tài)環(huán)境具有長期的破壞作用，也引起農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，農(nóng)藥殘留超標(biāo)、病原菌的耐藥 性以及對(duì)人畜有害等諸多問題。尋找更為安全、有效的病害防治方法具有重大的意義，利用 生物的方法來防治植物病害可以有效解決上述問題。
[0003] 三七(Panax notoginseng F.H.chen)又名田七、金不換等，具有顯著的活血化瘀、 消腫定痛功效，是一種中國傳統(tǒng)名貴藥材。以三七為主要原料制成的中成藥如"云南白藥" 和"片仔癀"等廣為流傳。近年來，對(duì)三七原材料的需求日益增長。但是栽培過程中的真菌病 害嚴(yán)重影響了三七生長。目前，在三七種植上，防治真菌病害過度依賴化學(xué)農(nóng)藥，大量化學(xué) 農(nóng)藥的使用不僅影響了三七的品質(zhì)，也造成了三七藥材的大量農(nóng)藥殘留。
[0004]三七炭疽病為三七生長常見病之一，苗期、成株期均可發(fā)病，葉片發(fā)病初期表現(xiàn)為 葉片生黃褐色斑點(diǎn)，后期病部易穿孔破裂。葉柄和莖感染后會(huì)形成黃褐色凹陷斑，果實(shí)感染 后變褐色腐爛，該病的病原為Colletotriehum gloeosporioides(簡稱 C.gloeosporioides)。這個(gè)真菌病害是造成多年來三七產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量下降的主要原因之 一。在廣西三七的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，由于低海拔及高溫多濕的氣象條件，這種病害往往是同時(shí) 發(fā)生的，造成了三七的大量減產(chǎn)甚至絕收，給種植戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了控制這個(gè) 真菌病害，大量的化學(xué)農(nóng)藥被使用，造成了三七產(chǎn)品的大量農(nóng)藥殘留，嚴(yán)重的污染了環(huán)境， 大大的威脅了人們的健康。因此，開展生物防治三七真菌病害對(duì)三七產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展是 非常迫切和必要的。為此篩選出能同時(shí)拮抗這種病害的拮抗菌具有重大意義，篩選進(jìn)而開 發(fā)利用拮抗菌也是有效控制三七真菌病害最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐未胧┲弧?br>[0005] 公開于該【背景技術(shù)】部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng) 當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1在防治三七炭疽病中的應(yīng) 用，從而能有效的防治三七種植過程中出現(xiàn)的三七炭疽病，從而提高三七的產(chǎn)量以及質(zhì)量。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1，越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1的分類命名為腐皮鐮 孢菌(Fusarium solani)TRXY-34_l，菌株的ITS序列如SEQ ID N0.1所述，保藏單位：中國微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中 國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期:2015年05月13日，保藏號(hào):CGMCC No. 10767。
[0009] 優(yōu)選的是，所述越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1代謝產(chǎn)物的制備方法為：
[0010] (1)將越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平面皿(PDA平 板）中，置于溫度為28°C下培養(yǎng)20天，所得培養(yǎng)材料切成塊狀并轉(zhuǎn)移到無菌固體培養(yǎng)基中， 置于28°C發(fā)酵60天；
[0011] (2)發(fā)酵完成后，用發(fā)酵物2倍的甲醇浸泡發(fā)酵物并超聲40min，然后過濾；
[0012] (3)重復(fù)步驟（2)兩次，合并兩次濾液進(jìn)行減壓濃縮成浸膏，得到內(nèi)生真菌TRXY-34-1發(fā)酵物的甲醇粗提物，即為越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1代謝產(chǎn)物。
[0013] 優(yōu)選的是，步驟（1)中所述的無菌固體培養(yǎng)基含400g馬鈴薯，20g的右旋糖和20g蔗 糖。
[0014] 如上述制備所得越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1的代謝產(chǎn)物在防治三七炭疽病中的應(yīng) 用。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0016] 本發(fā)明首次從藥用植物越南槐的根中分離篩選到一株內(nèi)生真菌（Fusarium solani)TRXY-34-l，該菌對(duì)三七炭疽病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，為三七真菌病害的生物防 治領(lǐng)域帶來廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1是本發(fā)明越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1與三七炭疽病的平板對(duì)峙培養(yǎng)，其中F為 三七炭疽病菌（0〇1161：〇1：1^6111111181〇6〇8。〇1'；[0丨(168)，3為空白對(duì)照，13為實(shí)驗(yàn)組 。
[0018]圖2是本發(fā)明越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1菌株形態(tài)特征，其中，al為菌落形態(tài)，bl為 菌體形態(tài)。
[0019]圖3為越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1菌株基于ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。
[0020]圖4是根據(jù)本發(fā)明菌株越南槐內(nèi)生真菌TRXY-34-1的代謝產(chǎn)物對(duì)三七炭疽病菌的 菌絲生長的抑制效果;其中第1、第5個(gè)為空白對(duì)照即不含藥的PDA平板;第2、第3、第4個(gè)為陽 性對(duì)照多菌靈粉劑;第6、第7、第8為菌株TRXY-34-1的代謝產(chǎn)物，且濃度分別為2mg/ml，4mg/ ml，8mg/ml ;T為三七炭疽病菌Colletotriehum gloeosporioides〇
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體 實(shí)施方式的限制。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施 例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。甲醇為市購分析純甲醇。 2X TagMasterMix購自寶生物工程有限公司（Takara)，Primer_l、Primer_2由華大基因合 成。
[0022] 實(shí)施例1
[0023]菌株的分離、篩選及鑒定
[0024] -、菌株的分離
[0025]供試材料:采自廣西天等縣石灰?guī)r地區(qū)的野生越南槐。
[0026]供試菌株:由廣西大學(xué)植物病理研究所提供。
[0027]培養(yǎng)基：1000ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基），Η)Α培養(yǎng)基含馬鈴薯300g、 葡萄糖20g、瓊脂20g和氯霉素0.1 g，培養(yǎng)基pH值為6.0 ± 0.2。
[0028] 表面消毒:將長為6-8cm、寬為l-2cm新鮮健康的越南槐根用流水沖洗30min以沖干 凈泥沙，然后將洗凈的越南槐根用無菌水漂洗2次，風(fēng)干表面水分，移到超凈工作臺(tái)，在無菌 條件下，將越南槐根用體積濃度為75%乙醇浸泡lmin，無菌水漂洗2次，次氯酸鈉(有效氯 1 % )浸泡2min，無菌水洗3次，無菌吸水紙吸干表面?zhèn)溆谩?br>[0029] 菌株的分離、純化:表面消毒好的越南槐根，無菌條件下，用無菌木片刮去表皮，用 無菌枝剪剪去越南槐根的兩端，余下部分用無菌小刀和無菌鑷子分開木質(zhì)部和韌皮部，并 用無菌枝剪剪成0.5cm長的組織塊，無菌轉(zhuǎn)接至制備好的TOA培養(yǎng)基(含氯霉素），28°C培養(yǎng)。 取表面消毒最后一次漂洗液涂布在PDA平板上，作為陰性對(duì)照。每天觀測，待組織周圍長出 菌絲，挑取單一菌絲，接于無抗生素的PDA培養(yǎng)基。長出的菌落，如果菌落形態(tài)不一致，繼續(xù) 挑取單一菌絲轉(zhuǎn)接PDA培養(yǎng)基，直至平板上新長出的菌落的外部形態(tài)一致。
[0030] 將分離到的內(nèi)生真菌接種于PDA平板內(nèi)，28°C下培養(yǎng)20天后待用。將三七炭疽病菌 接種于PDA平板，28°C下培養(yǎng)3天后待用。
[0031] 二、篩選
[0032] 采用平板對(duì)峙法對(duì)供試越南槐內(nèi)生真菌進(jìn)行菌體抑菌活性的初篩。
[0033]首先，無菌條件下，用滅菌打孔器將內(nèi)生真菌和三七炭疽病菌制成6mm菌餅;在處 理組中，將內(nèi)生真菌菌餅轉(zhuǎn)接到含TOA的培養(yǎng)皿中央，然后在內(nèi)生真菌的菌餅周圍等徑3cm 處放置三七炭疽病菌菌餅，每株內(nèi)生真菌重復(fù)3皿;在對(duì)照組中，PDA的培養(yǎng)皿中央不接內(nèi) 生真菌菌餅，在PDA的培養(yǎng)皿中央周圍等徑3cm處放置三七炭疽病菌菌餅，重復(fù)3皿。然后28 °C下培養(yǎng)，定期觀測。待對(duì)照組中菌絲長至PDA的培養(yǎng)皿平板中央，在處理組中，測量三七炭 疽病菌菌餅中心到內(nèi)生真菌菌餅中心之間三七炭疽病菌的生長半徑為處理生長半徑;在對(duì) 照組中，測量三七炭疽病菌菌餅中心到PDA的培養(yǎng)皿中心之間三七炭疽病菌的生長半徑為 對(duì)照生長半徑。最后，根據(jù)以下公式，計(jì)算抑菌率：
[0034] 對(duì)照生長量=對(duì)照生長半徑-菌餅半徑 [0035] 處理生長量=處理生長半徑-菌餅半徑
[0036]
[0037] 結(jié)果共得到4株對(duì)三七炭疽病菌抑制作用都很強(qiáng)的拮抗越南槐內(nèi)生真菌菌株，其 中一株名稱為TRXY-34-1，對(duì)三七炭疽病菌的抑制率為79%。
[0038] 三、鑒定
[0039](一）菌株形態(tài)特征
[0040]菌體形態(tài)特征觀察:將待鑒定的內(nèi)生菌真菌菌株TRXY-34-1接種在PDA培養(yǎng)基上， 置于28°C培養(yǎng)，分別在5、14及20天觀察其培養(yǎng)特征和顏色變化。取穩(wěn)定成熟的顏色特征作 為其培養(yǎng)特征，作為鑒定的依據(jù)。觀察記錄氣生菌絲的顏色，菌落的大小、顏色、組織形狀、 表面形狀等作為參考特征。
[00411孢子形態(tài)特征觀察:將待鑒定的內(nèi)生菌真菌菌株TRXY-34-1作插片培養(yǎng)，當(dāng)在PDA 培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢子，將菌絲轉(zhuǎn)接于含無菌越南槐根的低營養(yǎng)培養(yǎng)基（四分之一濃度PDA)上 以誘導(dǎo)孢子，將所觀察到的形態(tài)結(jié)果顯微照相，如圖2所示。
[0042](二)菌株ITS序列及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 [0043] DNA模板的制備：
[0044] 試劑：（1)裂解緩沖液：Tris-Ac(pH 7.8)40mM，NaAc 20mM，EDTA lmM，SDS l%(w/ v)；
[0045] (2)5M NaCl溶液。
[0046] DNA 提取：
[0047] 加600yL提取液（Tris-Ac(pH 7.8)40mM，NaAc 20mM，EDTA lmM，SDS 1%)到 1.5ml 離心管(EP管），用棒刮取少量菌絲放入EP管研磨，65°C水浴30min，離心轉(zhuǎn)速12000r/min，離 心lOmin;
[0048] 取離心所得上清液400yL，加 5M NaCL lOOyL，冰浴lOmin;
[0049] 然后在溫度為4°C下保持離心轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心10min，取上清液;加上清液 〇 . 6倍異丙醇與上清液混勻（或2倍無水乙醇）冰浴1 h，保持離心轉(zhuǎn)速12000r/miη，離心 lOmin，棄去上清液后所得余下物質(zhì)晾干，加20yL雙蒸水(ddH20)，取l-2yL做DNA模板。
[0050] PCR 擴(kuò)增 ITS 序列：
[0051] (l)PCR儀：ABI 3730-XL DNA測序儀（Applied Biosystems,USA);
[0052] (2)擴(kuò)增引物dTSKS'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-S')如SEQ ID N0.2所示，和ITS4 (S'-TCCTCCGCTTATTGATATGCH^)如SEQ ID N0.3所示；
[0053] (3)擴(kuò)增體系：
[0054] ITS序列PCR擴(kuò)增體系如表1所示:表