工業(yè)產(chǎn)量的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種能促進類球紅細菌Rh〇 d〇bac t er sphaeroides產(chǎn)輔酶Q1Q菌株活性及產(chǎn)量的特有培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 輔酶Qio(Coenzyme Qiq)又稱泛醌(Ubiquinone，縮寫UQ)，是一種存在于自然界的 脂溶性醌類化合物，是生物體內(nèi)電子傳遞鏈上重要的遞氫體。在人類身體細胞內(nèi)參與能量 制造及活化，是預(yù)防動脈硬化形成最有效的抗氧化成份。輔酶Q 1Q能激活人體細胞和細胞能 量的營養(yǎng)，具有提高人體免疫力、增強抗氧化、延緩衰老和增強人體活力等功能，醫(yī)學(xué)上廣 泛用于心血管系統(tǒng)疾病，國內(nèi)外廣泛將其用于營養(yǎng)保健品及食品添加劑。
[0003] 輔酶Q1Q的制備方法主要有三種：動植物組織細胞提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā) 酵法。動植物細胞提取法由于生產(chǎn)效率較低，工藝落后，目前在工業(yè)化生產(chǎn)中已基本不用。 例如，公開號為CN 102391093A的中國發(fā)明專利申請公開了一種從煙草中提取輔酶Q1Q的方 法，其工藝流程是:將已與培養(yǎng)液分離的煙草懸浮培養(yǎng)細胞或煙草懸浮培養(yǎng)組織塊和75~ 85 %乙醇-石油醚溶液混合勻漿5~10分鐘，勻漿結(jié)束后上述勻漿混合物過濾，靜置分層，上 層溶液濃縮后即得輔酶Q1Q的粗提物。
[0004] 用化學(xué)合成法生產(chǎn)輔酶Q1Q，例如，公開號為CN 1931818的中國發(fā)明專利申請公開 了一種合成輔酶Q1Q的方法。該方法是以輔酶Qo氫醌和含量不低于95%的異癸十異戊二烯基 醇為原料，經(jīng)脫水后，在無氧環(huán)境中經(jīng)三氟甲磺酸及其金屬鹽催化，室溫條件下縮合反應(yīng)， 得到輔酶Q 1Q氫醌，?；瘜W(xué)合成法產(chǎn)率相對較低，且用茄呢醇制得的烯丙基化試劑是順、反異 構(gòu)體的混合物，活性不強，需要分離，因此這種方法的應(yīng)用受到了限制。
[0005] 微生物發(fā)酵法是近幾年全球開發(fā)的熱點，被認為是最有前途的生產(chǎn)方式。利用微 生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q1Q，無論是從產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性方面，都有較大的競爭優(yōu)勢，適用于 大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 例如公開號為CN 101024849的中國發(fā)明專利申請公開了一種輔酶Q1Q的光合細菌 發(fā)酵法:利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建、篩選高產(chǎn)輔酶Q 1Q光合細菌菌株，同時，采用化學(xué)物質(zhì)或紫外 線致突變，利用類胡蘿卜素合成抑制劑和生長抑制劑篩選高產(chǎn)輔酶Q 1()光合細菌突變體，實現(xiàn) 高產(chǎn)輔酶Qiq菌株的選育和培育。公開號為CN 1884562的中國發(fā)明專利申請公開了一種生產(chǎn) 輔酶Q1Q的方法，采用發(fā)酵方法生產(chǎn)，發(fā)酵所采用的菌種為農(nóng)桿菌LQ 10。
[0007] 現(xiàn)有的微生物發(fā)酵法尤其是采用工程菌時都存在輔酶Q1Q工業(yè)產(chǎn)量不高的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一種提高輔酶Q1()工業(yè)產(chǎn)量的生產(chǎn)方法，解決了現(xiàn)有發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶 Q1〇工業(yè)產(chǎn)量不高的技術(shù)問題。
[0009] -種提高輔酶Q1Q工業(yè)產(chǎn)量的生產(chǎn)方法，包括:將保藏號為CGMCC No.5997、CGMCC No. 5998或CGMCC No. 5999的菌株依次經(jīng)復(fù)蘇和種子培養(yǎng)基擴培后篩選得到發(fā)酵種子，將所 得發(fā)酵種子擴培后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得輔酶QiQ，種子培養(yǎng)基中Fe2+的 濃度為〇 · 1~〇 · 5mol/L。
[0010] 保藏號為CGMCC No.5997的菌株為類紅球細菌，拉丁文學(xué)名為rhodobacter sphaeroides，命名為 NHU-ZUB 菌株。
[0011 ] CGMCC No · 5998的菌株為類紅球細菌，拉丁文學(xué)名為rhodobacter sphaeroides， 命名為NHU-ZDD菌株。
[0012] CGMCC No · 5999的菌株為類紅球細菌，拉丁文學(xué)名為rhodobacter sphaeroides， 命名為NHU-ZAA菌株。
[0013] 以上菌株均為申請人在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏并 存活的菌株。
[0014] 在微生物發(fā)酵生產(chǎn)中，菌種的優(yōu)良是整批發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)量高低的關(guān)鍵，在菌株接入 大罐之前，選擇優(yōu)秀的菌株是高產(chǎn)的保證，菌種篩選是提高菌種質(zhì)量、穩(wěn)定發(fā)酵水平的重要 手段。而適宜的生長環(huán)境是菌株快速生長的保證，給予菌株充足的需求，才能讓菌株不受短 板效應(yīng)的限制，最大程度地為生產(chǎn)服務(wù)。
[0015] 輔酶Q1Q是生物體內(nèi)電子傳遞鏈上重要的遞氫體，因而增強電子傳遞鏈強度有利于 輔酶Q1()的積累。其中，鐵離子是電子傳遞鏈中鐵硫蛋白、細胞色素以及生物體內(nèi)血紅蛋白的 重要輔基。
[0016] 本發(fā)明研究人員研究中發(fā)現(xiàn)，目前已公開的報道中，鐵離子用做培養(yǎng)基的微量促 進劑使用，而鮮見利用培養(yǎng)基中添加鐵離子濃度來篩選適用工業(yè)生產(chǎn)使用的菌種，尤其適 合經(jīng)基因工程改造后的菌種。
[0017] 本發(fā)明在保持輔酶Q1()發(fā)酵原有品質(zhì)的前提下，根據(jù)輔酶Q1()生產(chǎn)菌的生理特性，通 過大量的搖瓶工藝優(yōu)化實驗，以有效提高菌株活性和輔酶Q 1Q產(chǎn)量為目的，建立一種有效可 行的培養(yǎng)篩選方法，找到了 一種能有效提高輔酶Q1Q生產(chǎn)菌株菌體活性和生產(chǎn)產(chǎn)量的發(fā)酵培 養(yǎng)方法，并在生產(chǎn)中實現(xiàn)了擴大，有效提高了生產(chǎn)產(chǎn)量。
[0018] 優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基中Fe2+的濃度為0.1~0.3mol/L;更進一步優(yōu)選地，種子培 養(yǎng)基中Fe 2+的濃度為0.3mol/L〇
[0019] 進一步優(yōu)選地，種子培養(yǎng)基中擴培的培養(yǎng)條件為：30~32°C避光培養(yǎng)22~24h。滅 菌溫度121°C，滅菌時間20min。
[0020] 優(yōu)選地，所述復(fù)蘇依次在平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基中進行，平板培養(yǎng)基和種子培 養(yǎng)基中Fe2+的濃度均為0.1~0.5mol/L〇
[0021 ]進一步優(yōu)選地，所述平板培養(yǎng)基中Fe2+的濃度為0.1~0.3mol/L;更進一步優(yōu)選地， 所述平板培養(yǎng)基中Fe2+的濃度為0.3mol/L。
[0022] 進一步優(yōu)選地，所述斜面培養(yǎng)基中Fe2+的濃度為0.1~0.3mol/L;更進一步優(yōu)選地， 所述斜面培養(yǎng)基中Fe 2+的濃度為0.3mol/L。
[0023] 進一步優(yōu)選地，斜面培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為30~32°C避光培養(yǎng)60~80h。滅菌溫度 121°C，滅菌時間20min。
[0024] 優(yōu)選地，F(xiàn)e2+以氯化鐵、硫酸亞鐵和檸檬酸鐵中的至少一種化合物形式添加到培養(yǎng) 基中。
[0025]更優(yōu)選地，平板培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基中Fe2+的濃度均為0.1~0.3mol/ L;最優(yōu)選地，平板培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基中Fe2+的濃度均為0.3mol/L。
[0026]本發(fā)明所用平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基為類紅球菌常用培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、無 機鹽、維生素等常規(guī)成分。
[0027]優(yōu)選地，平板培養(yǎng)基（每100mL)成分為：葡萄糖0.3g，酵母提取物0.8g，氯化鈷 0.003g，氯化鈉0.2g，硫酸錳0.0 OOlg，磷酸氫二鉀0.13g，硫酸鎂0.025g，維生素 BIO. lug，維 生素 K 0· lug，維生素 A 0· 15ug，瓊脂粉1.5g，再添加0· 1~0.5mol/L的Fe^pH為7.2,滅菌條 件可以為118°C，lOmin。
[0028]斜面培養(yǎng)基的成分(每100mL)為:葡萄糖0.3g，酵母提取物0.8g，氯化鈷0.003g，氯 化鈉0.2g，硫酸錳0.000lg，磷酸氫二鉀0.13g，硫酸鎂0.025g，維生素 BIO . lug，維生素 K 0.1呢，維生素八0.15呢，瓊脂粉1.28;再添加0.1~0.5111〇1凡的？62+<^!1為7.2，滅菌條件可以 為 118°C，10min。
[0029] 種子培養(yǎng)基(每100mL)成分為:硫酸銨0.25g，玉米漿0.05g，葡萄糖0.3g，酵母提取 物〇.14g，氯化鈷0.003g，氯化鈉0.2g，硫酸錳O.OOOlg，磷酸氫二鉀0.05g，磷酸二氫鉀 0.05g，硫酸鎂0. lg，碳酸鈣0.8g，維生素 B10. lug，維生素 K 0. lug，維生素 A 0.15ug，再添加 0 · 1~0 · 5mol/L的Fe^pH 為7 · 2