用于使用代謝工程化丙酸桿菌產(chǎn)生正丙醇和丙酸的方法
【專利說明】
[0001 ]本申請(qǐng)案要求2012年12月21日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案61/740,490的優(yōu)先權(quán)， 所述申請(qǐng)案以全文引用的方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及代謝工程化細(xì)菌，以及其制備和其在一種用于將生物基底物生物轉(zhuǎn)化 成含有正丙醇、丙酸或其組合的產(chǎn)物的方法中的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 對(duì)化石燃料的未來稀缺、成本和環(huán)境影響的顧慮已經(jīng)激起人們對(duì)開采廉價(jià)、可再 生生物質(zhì)作為燃料和化學(xué)品的替代來源的關(guān)注。由于原油價(jià)格已經(jīng)上漲，生物基化學(xué)品和 工業(yè)產(chǎn)品已經(jīng)變?yōu)閬碓从谑偷膶?duì)應(yīng)物的有吸引力的替代方案。使用厭氧微生物的發(fā)酵方 法提供用于將生物質(zhì)和農(nóng)業(yè)廢物轉(zhuǎn)化成化學(xué)品和燃料的有前景的途徑。存在大量的需要適 當(dāng)處置以避免污染問題的低值農(nóng)業(yè)商品和食品加工副產(chǎn)品/廢物。這些生物質(zhì)廢物材料可 以用作生產(chǎn)燃料和化學(xué)品（例如有機(jī)酸和醇）的低成本原料。通過發(fā)酵途徑衍生的產(chǎn)物尤其 為正丙醇和丙酸。
[0004] 正丙醇（1-丙醇、伯丙醇、丙-1-醇）為可與水和其它常用溶劑自由混溶的無害溶 劑，其在工業(yè)中有大量應(yīng)用。這些應(yīng)用包括例如印刷墨、涂料、清潔劑、粘合劑、除草劑、殺昆 蟲劑、藥物、除冰流體，以及作為用于生產(chǎn)酯、丙胺、鹵化物和熱塑性樹脂的中間物。還已經(jīng) 提出了在燃料摻合物中使用正丙醇，因?yàn)檫@種醇具有與乙醇相同的用于增加辛烷值以及充 當(dāng)汽油中的抗爆添加劑的能力。
[0005] 舉例來說，丙酸是廣泛用于生產(chǎn)纖維素塑料、除草劑以及香料的重要化學(xué)品。丙酸 也是重要的防霉劑。其氨鹽、鈣鹽、鈉鹽以及鉀鹽廣泛用作食品和飼料防腐劑。某些其它羧 酸也具有工業(yè)價(jià)值，例如琥珀酸，其能夠氫解以產(chǎn)生丁二醇，所述丁二醇適用于生產(chǎn)聚酯和 熱成型樹脂。
[0006] 雖然正丙醇與丙酸兩者都可以通過發(fā)酵方法產(chǎn)生，但許多常規(guī)發(fā)酵方法具有生產(chǎn) 率(productivity)、產(chǎn)率(yield)以及最終產(chǎn)物濃度和純度低的問題，并且其對(duì)于商業(yè)應(yīng)用 而言是不經(jīng)濟(jì)的。目前，大部分商業(yè)出售的丙酸通過石油化學(xué)方法產(chǎn)生。然而，人們對(duì)通過 丙酸桿菌由糖的發(fā)酵來產(chǎn)生丙酸的關(guān)注已經(jīng)逐漸增加。盡管通過各種方法和菌株改良來提 升發(fā)酵生產(chǎn)率和最終產(chǎn)物濃度已經(jīng)取得一些成功，但在發(fā)酵方法中如何進(jìn)一步提升丙酸產(chǎn) 率和純度仍然是一個(gè)難題。開發(fā)用于化學(xué)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)上可行的發(fā)酵方法需要不僅具有高生 產(chǎn)率并且可以容許高濃度的發(fā)酵產(chǎn)物的微生物。
[0007] 用于改良工業(yè)微生物的方法在經(jīng)典菌株改良（CSI)的隨機(jī)方法到代謝工程的極合 理方法范圍內(nèi)。盡管CSI是眾所周知并且常用的方法，但其就時(shí)間與資源兩者而言都是密集 型的。為了獲得對(duì)抑制性發(fā)酵產(chǎn)物具有高耐受性的菌株，通過在培養(yǎng)基中用逐漸增加的抑 制劑濃度連續(xù)培養(yǎng)來連續(xù)篩選和選擇突變體通常與通過化學(xué)誘變劑或紫外線(UV)輻射來 誘發(fā)誘變結(jié)合使用。然而，常規(guī)的培養(yǎng)物篩選過程是冗長(zhǎng)、耗時(shí)的并且通常是徒勞的。最近， 還已經(jīng)對(duì)重組DNA技術(shù)加以應(yīng)用來提升對(duì)抑制性產(chǎn)品的細(xì)胞耐受性。這些方法通常更有效， 但使用起來也更復(fù)雜，并且需要了解在基因水平上的詳細(xì)抑制機(jī)制，這對(duì)于受到特別工業(yè) 關(guān)注的多數(shù)微生物而言是無法獲得的。
[0008] 代謝工程廣泛用于設(shè)計(jì)工程化菌株以通過改變代謝流量分布來實(shí)現(xiàn)代謝過度生 產(chǎn)的較高效率。迄今為止的大部分代謝工程研究與使用生物來產(chǎn)生次級(jí)代謝物(例如抗生 素）、氨基酸(例如賴氨酸）以及異源蛋白質(zhì)有關(guān)，所述生物具有經(jīng)充分研究的遺傳學(xué)和生理 學(xué)(例如，大腸桿菌(E.coli)、酵母以及雜交瘤細(xì)胞）。對(duì)代謝流量分布的化學(xué)計(jì)量分析為代 謝工程、最佳培養(yǎng)基調(diào)配和喂養(yǎng)策略以及生物過程最佳化提供指導(dǎo)，然而其需要對(duì)發(fā)酵細(xì) 胞中的代謝和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的深入了解。盡管合理代謝工程方法已經(jīng)在涉及單個(gè)基因或一個(gè)基 因簇內(nèi)的一些基因的情況下取得成功，但其在涉及復(fù)雜或在很大程度上未知的代謝途徑的 許多情況下是無效的。這是因?yàn)楹侠泶x工程方法通常一次靶向一個(gè)基因，并且因此不能 預(yù)測(cè)途徑中的多個(gè)基因之間的復(fù)雜相互作用。
[0009] 丙酸桿菌是革蘭氏陽(yáng)性(Gram-positive)、過氧化氫酶陽(yáng)性、無芽孢形成、不動(dòng)、兼 性厭氧的桿狀細(xì)菌。丙酸桿菌屬(Propionibacterium)的成員（以復(fù)數(shù)形式或以在這個(gè)屬內(nèi) 的任何單個(gè)但未鑒別的物種的形式，統(tǒng)稱為"丙酸桿菌（p r 〇 p i ο n i b a c t e r i a或a propionibacteria)"廣泛用于產(chǎn)生維生素 B12、四吡略化合物和丙酸，以及用于益生菌和乳 酪工業(yè)。如圖1所示，丙酸桿菌通過二羧酸途徑產(chǎn)生丙酸，其中產(chǎn)生乙酸鹽和琥珀酸鹽作為 副產(chǎn)物。理論上，當(dāng)糖酵解是通過恩伯登-梅耶霍夫-帕納斯(Embden-Meyerhof-Parnas， EMP)途徑時(shí)，一摩爾(mol)葡萄糖僅產(chǎn)生4/3mol丙酸鹽和2/3mol醋酸鹽。當(dāng)存在顯著細(xì)胞生 長(zhǎng)和生物質(zhì)形成時(shí)，實(shí)際丙酸鹽產(chǎn)率低得多。即使在10克每升(g/L)的相對(duì)低濃度下，丙酸 鹽也是對(duì)發(fā)酵的強(qiáng)抑制劑。典型分批丙酸發(fā)酵需要大致3天以達(dá)到20g/L丙酸，其丙酸產(chǎn)率 通常小于0.5克每克(g/g)葡萄糖。丙酸桿菌廣泛用于工業(yè)中，并且已經(jīng)對(duì)其中的若干種的 基因組進(jìn)行完全測(cè)序。參見例如帕里奇（Parizzi)等人，"丙酸丙酸桿菌（Propioni-bacterium acidipropionici)的基因組序列對(duì)其生物技術(shù)和工業(yè)潛能提供深入了解(The genome sequence of Propioni-bacterium acidipropionici provides insights into its biotechnological and industrial potential)，"《BMC基因組學(xué)》(BMC Genomics)， 第 13 卷，2012,562-602。
[0010] 盡管迄今為止丙酸桿菌已經(jīng)受到關(guān)注，然而，幾乎沒有研究針對(duì)這些細(xì)菌的遺傳 工程，這是由于其基因組中的高GC含量、轉(zhuǎn)化革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的困難以及克隆工具的缺乏。 迄今為止，僅已基于最初從丙酸丙酸桿菌(P. acidipropionici)中分離的質(zhì)粒開發(fā)了兩個(gè) 表達(dá)載體（其使用兩個(gè)不同的啟動(dòng)子）pKHEM01和pKHEM04(參見例如庫(kù)亞特帕潘 (Kiatpapan)等人，"構(gòu)建用于丙酸桿菌的表達(dá)載體以及其在通過費(fèi)氏丙酸桿菌 (Propionibacterium freudenreichii)產(chǎn)生5_氨基乙酰丙酸中的用途（Construction of an expression vector for propionibacteria and its use in production of 5_ aminolevulinic acid by Propionibacterium freudenreichii)，"〈〈應(yīng)用微生物生物技 術(shù)》(Appl .Microbiol .Biotechnol.)，第56卷，2001，144-149)，以及兩個(gè)報(bào)導(dǎo)子載體(其不 具有啟動(dòng)子)ρ?)210(法頁(yè)(Faye)等人，"構(gòu)建用于費(fèi)氏丙酸桿菌中的啟動(dòng)子活性的活體內(nèi) 分析的報(bào)導(dǎo)子向量系統(tǒng)（Construction of a reporter vector system for in vivo analysis of promoter activity in Propionibacterium freudenreichii)，'，《應(yīng)用和環(huán) 境微生物學(xué)》(Appl .and Enviro.Microbiology)，第74卷，第 11 期，2008,3615_3617) ;pCVEl (皮奧(Piao)等人，"來自費(fèi)氏丙酸桿菌的啟動(dòng)子元件的分子分析(Molecular analysis of promoter elements from Propionibacterium freudenreichii)，"《生物科學(xué)與生物工程 學(xué)雜志》(J.Biosci.and Bioeng)，第97卷，第5期，2004,310-316)。這一領(lǐng)域中的大部分發(fā) 表的研究旨在提升維生素 B12產(chǎn)量(參見例如庫(kù)亞特帕潘等人，如上所引用;室岡(Murooka) 等人，"使用費(fèi)氏丙酸桿菌的遺傳工程產(chǎn)生四吡咯化合物和維生素 B12.概述(Production of tetrapyrro1e compounds and vitamin B 12using genetic engineering of Propionibacterium freudenreichii .An overview)，"《萊特》(Lait)，第85卷，第 1 到2期， 2005,9-22;并且僅有一篇論文已關(guān)注通過敲除丙酸丙酸桿菌ATCC4875中的乙酸激酶(ack) 基因來提升丙酸產(chǎn)量(蘇瓦納卡姆（Suwannakham)等人，"構(gòu)建和表征丙酸丙酸桿菌的基因 敲除突變體用于增強(qiáng)的丙酸發(fā)酵(Construction and characterization of knock-out mutants of Propionibacterium acidipropionici for enhanced propionic acid fermentation)，"《威立國(guó)際科學(xué)》（Wiley InterScience) (www. interscience .wiley · com)，2006年2月28日；另外參見帕里奇等人，如上所引用）。 [0011]已經(jīng)顯示雙功能醛/醇脫氫酶能夠?qū)⒁阴?CoA和丁酰-CoA分別轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇 (參見例如納爾(Nair)等人，"來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium ac