一種長(zhǎng)效低毒和具有氧化響應(yīng)的鐵離子螯合劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及聚合物，具體涉及一種去鐵胺接枝氧化海藻酸鈉，還涉及其作為鐵離 子螯合劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵離子過(guò)載與各種疾病相關(guān)，如腦出血后血紅蛋白降解產(chǎn)生的鐵離子會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重 的腦損傷，如腦水腫、神經(jīng)元死亡、腦萎縮及神經(jīng)功能的缺失等。
[0003] 去鐵胺是一種鐵離子鰲合劑，在臨床上已經(jīng)使用了30余年，用于治療各種原因引 起的急慢性鐵過(guò)載。然而，在血液中的去鐵胺會(huì)被體內(nèi)的酶快速降解，其半衰期僅為20分 鐘。因此要達(dá)到一定的藥效就需要大劑量攝入，但是在大劑量下該藥會(huì)導(dǎo)致毒性作用。因 此，在臨床上所以臨床上一直采用低劑量下長(zhǎng)時(shí)間的靜脈注射來(lái)維持其在體內(nèi)的濃度以達(dá) 到一定的治療效果，治療時(shí)十分不便，也容易產(chǎn)生累積毒性。
[0004] 海藻酸鈉是一種天然多糖，其結(jié)構(gòu)為β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)的 無(wú)規(guī)嵌段共聚物，其結(jié)構(gòu)式和連接方式如下：
[0006] 目前尚沒(méi)有將海藻酸鹽與去鐵胺結(jié)構(gòu)基團(tuán)相結(jié)合的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種以海藻酸鈉為載體的去鐵胺。
[0008] 本發(fā)明提供了一種改性氧化海藻酸鈉，它是去鐵胺接枝的改性氧化海藻酸鈉。
[0009] 進(jìn)一步地，它具有下述式(I)所示的結(jié)構(gòu)：
[0010] Rn-CH2-DFO (I)
[0011]其中，Rn表示氧化海藻酸鈉主鏈，DFO表示去鐵胺基，結(jié)構(gòu)如下：
[0013] 進(jìn)一步地，去鐵胺基的數(shù)量/海藻酸鈉結(jié)構(gòu)單元=0.05~0.5。
[0014] 本發(fā)明中，所述"海藻酸鈉結(jié)構(gòu)單元"指的是未被氧化的糖醛酸結(jié)構(gòu)單元(G單元或 M單元)與氧化后的糖醛酸結(jié)構(gòu)單元(包括接枝和未接枝的)之和，例如圖1中海藻酸鈉-鐵離 子螯合劑，該片段中所示的海藻酸鈉結(jié)構(gòu)單元的數(shù)量為4,去鐵胺基的數(shù)量為3。
[0015]進(jìn)一步地，所述氧化海藻酸鈉的氧化度為5%~42%。
[0016] 進(jìn)一步地，所述改性氧化海藻酸鈉的重均分子量為10000-300000Da。
[0017] 更進(jìn)一步地，所述改性氧化海藻酸鈉的重均分子量為62000_290000Da。
[0018] 進(jìn)一步地，所述改性氧化海藻酸鈉在2931cm-\2858cm-1和1460cm- 1處有紅外吸收 峰;在核磁氫譜1.2-3.5ppm和3.6-4.9ppm的化學(xué)位移處有峰。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種制備所述接枝氧化海藻酸鈉的方法，包括以下步驟：
[0020] 取氧化海藻酸鈉，溶于水中，加入去鐵胺反應(yīng)完全，再加入硼氫化試劑反應(yīng)，分離 純化即得。
[0021 ]進(jìn)一步地，所述硼氫化試劑選自氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉。
[0022] 進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述硼氫化試劑選自氰基硼氫化鈉或/和硼氫化鈉。
[0023] 進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，是先加入氰基硼氫化鈉，再加入硼氫化鈉。
[0024] 進(jìn)一步地，所述氧化海藻酸鈉與去鐵胺的質(zhì)量比為1:1~1:3.6;所述硼氫化試劑 與去鐵胺的摩爾比為3:1。
[0025] 本發(fā)明還提供了所述改性氧化海藻酸鈉作為鐵離子螯合劑的應(yīng)用，具體的機(jī)理如 圖1的海藻酸鈉-去鐵胺螯合劑所示。
[0026]本發(fā)明的去鐵胺接枝氧化海藻酸鈉解決了傳統(tǒng)鐵離子螯合劑去鐵胺的缺點(diǎn)，利用 親水生物相容好的海藻酸鈉對(duì)去鐵胺進(jìn)行了化學(xué)修飾。經(jīng)試驗(yàn)證明，其不但可以對(duì)去鐵胺 起到保護(hù)的作用，避免被體內(nèi)的酶快速降解，提高其半衰期和降低毒性，而且引入的海藻酸 鈉分子鏈段還能響應(yīng)由于鐵離子過(guò)載產(chǎn)生的氧化環(huán)境而快速降解從而排除體外，避免產(chǎn)生 積累毒性。因此，相比于目前臨床上直接使用去鐵胺，本發(fā)明制備的新型藥物可同時(shí)提供長(zhǎng) 效低毒去鐵和氧化響應(yīng)降解的功能。同時(shí)，本發(fā)明產(chǎn)品所需的生產(chǎn)條件要求較低、容易實(shí) 現(xiàn)，并且原材料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，具備廣闊的應(yīng)用前景。
[0027] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0028] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為本發(fā)明海藻酸鈉-去鐵胺螯合劑的合成及去鐵胺螯合鐵離子示意圖。
[0030] 圖2為△181、厶182、0卩0、厶0厶1、厶0厶2、厶18-0卩01和厶1 8-0卩02的紅外圖譜。
[0031] 圖3為△181、厶182、0卩0、厶0厶1、厶0厶2、厶18-0卩01和厶1 8-0卩02的核磁氫譜。
[0032] 圖4為實(shí)施例7中穩(wěn)定性和半衰期試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果。
[0033]圖5為實(shí)施例7中的氧化響應(yīng)試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果。
[0034]圖6-8依次為實(shí)施例7中為1天、2天和4天的細(xì)胞活率MTT測(cè)試結(jié)果。
[0035]圖9為實(shí)施例7中細(xì)胞毒性試驗(yàn)中細(xì)胞形態(tài)觀察圖，標(biāo)尺為50微米。
【具體實(shí)施方式】
[0036]所用原料和試劑均來(lái)自于市售的商品。
[0037]海藻酸鈉4]^1(81811^，粘度大或等于2000〇口8)，海藻酸鈉4]^2(青島晶巖，粘度 IOOcps)去鐵胺DFO(sigma) ;MTT(sigma);氰基硼氫化鈉和硼氫化鈉(上海阿拉丁試劑)過(guò)氧 化氫(成都科龍）。
[0038]實(shí)施例1去鐵胺接枝氧化海藻酸鈉的制備
[0039]取5克海藻酸鈉 Algl溶于400毫升蒸餾水中，加入0.27克高碘酸鈉，避光攪拌12小 時(shí)后，加入5毫升乙二醇攪拌2小時(shí)終止反應(yīng)。然后加入5克氯化鈉和1升乙醇沉淀分離得到 氧化海藻酸鈉，反復(fù)溶解沉淀3次除去多余雜質(zhì)后，透析3天，然后冷凍干燥得到高純度的氧 化海藻酸鈉。氧化度采用鹽酸輕胺法滴定(Xu,et al .Carbohydrate Polymers ,2013,95， 148-154.)測(cè)得為5 %。
[0040] 取0.5克氧化海藻酸鈉溶于30毫升蒸餾水中，然后加入0.5克去鐵胺攪拌反應(yīng)，2小 時(shí)后加入與去鐵胺等摩爾的氰基硼氫化鈉，攪拌還原4小時(shí)。然后加入2倍去鐵胺摩爾量的 硼氫化鈉繼續(xù)攪拌還原24小時(shí)。最后反應(yīng)液透析3天，每天換一次水，然后冷凍干燥得到鐵 離子螯合劑。
[0041] 去鐵胺含量采用分光光度法(Hallaway，et al.PNAS，1989,86,10108-10112.)檢 測(cè)，結(jié)果為每20個(gè)海藻酸鈉結(jié)構(gòu)單元含有1個(gè)去鐵胺分子。分子量采用凝膠色譜檢測(cè)，結(jié)果 為290kDa。
[0042] 實(shí)施例2去鐵胺接枝氧化海藻酸鈉的制備
[0043]取5克海藻酸鈉 Algl溶于400毫升蒸餾水中，加入0.81克高碘酸鈉，避光攪拌6小時(shí) 后，加入10毫升乙二醇攪拌2小時(shí)終止反應(yīng)。然后加入5克氯化鈉和1升乙醇沉淀分離得到氧 化海藻酸鈉，反復(fù)溶解沉淀3次除去多余雜質(zhì)后，透析3天，然后冷凍干燥得到高純度的氧化 海藻酸鈉。氧化度采用鹽酸羥胺法滴定測(cè)得為13.1 %。
[0044] 取0.5克氧化海藻酸鈉溶于30毫升蒸餾水中，然后加入0.8克去鐵胺攪拌反應(yīng)，2小 時(shí)后加入與去鐵胺等摩爾的氰基硼氫化鈉，攪拌還原4小時(shí)。然后加入2倍去鐵胺摩爾量的 硼氫化鈉繼續(xù)攪拌還原24小時(shí)。最后反應(yīng)液透析3天，每天換一次水，然后冷凍干燥得到鐵 離子螯合劑。去鐵胺含量采用分光光度法檢測(cè)，結(jié)果為每11個(gè)海藻酸鈉結(jié)構(gòu)單元含有1個(gè)去 鐵胺分子。分子量采用凝膠色譜檢測(cè)，結(jié)果為245kDa。
[0045] 實(shí)施例3去鐵胺接枝氧化海藻酸鈉的制備
[0046]取5克海藻酸鈉 Algl溶于400毫升蒸餾水中，加入1.62克高碘酸鈉，避光攪拌6小時(shí) 后，加入15毫升乙二醇攪拌2小時(shí)終止反應(yīng)。然后加入5克氯化鈉和1升乙醇沉淀分離得到氧 化海藻酸鈉，反復(fù)溶解沉淀3次除去多余雜質(zhì)后，透析3天，然后冷凍干燥得到高純度的氧化 海藻酸鈉 ADAl。氧化度采用鹽酸羥胺法滴定測(cè)得為26.8%。
[0047] 0.5克氧化海藻酸鈉溶于30毫升蒸餾水中然后加入1.2克去鐵胺攪拌反應(yīng)，2小時(shí) 后加入與去鐵胺等摩爾的氰基硼氫化鈉，攪拌還原4小時(shí)。然后加入2倍去鐵胺摩爾量的硼 氫化鈉繼續(xù)攪拌還原24小時(shí)。最后反應(yīng)液透析3天，每天換一次水，然后冷凍干燥得到鐵離 子螯合劑Alg-DFOl。去鐵胺含量采用分光光度法檢測(cè)，結(jié)果為每7個(gè)海藻酸鈉結(jié)構(gòu)單元含有 1個(gè)去鐵胺分子。分子量采用凝膠色譜檢測(cè)，結(jié)果為128kDa。
[0048] 實(shí)施例4去鐵胺接枝氧化海藻酸鈉的制備
[0049]取5克海藻酸鈉 Alg2溶于400毫升蒸餾水中，加入1.62克高碘酸鈉，避光攪拌6小時(shí) 后，加入15毫升乙二醇攪拌2小時(shí)終止反應(yīng)。然后加入5克氯化鈉和1升乙醇沉淀分離得到氧 化海藻酸鈉，反復(fù)溶解沉淀3次除去多余雜質(zhì)后，透析3天，然后冷凍干燥得到高純度的氧化 海藻酸鈉 ADA2。氧化度采用鹽酸羥胺法滴定測(cè)得為28.6%。
[0050] 0.5克氧化海藻酸鈉溶于30毫升蒸餾水中然后加入1.2克去鐵胺攪拌反應(yīng)，2小時(shí) 后加入與去鐵胺等摩爾的氰基硼氫化鈉，攪拌還原4小時(shí)。然后加入2倍去鐵胺摩爾量的硼 氫化鈉繼續(xù)攪拌還原24小時(shí)。最后反應(yīng)液透析3天，每天換一次水，然后冷凍干燥得到鐵離 子螯合劑Alg_DF02。去鐵胺含量采用分光光度法檢測(cè)，結(jié)果為每7個(gè)海藻酸鈉結(jié)構(gòu)單元含有 1個(gè)去鐵胺分子。分子量采用凝膠色譜檢測(cè)，結(jié)果為87kDa。
[0051 ]實(shí)施例5去鐵胺接枝氧化海藻酸鈉的制備
[0052]取5克海藻酸鈉 Algl溶于400毫升蒸餾水中，加入2.7克高碘酸鈉避光攪拌6小時(shí) 后，加入20毫升乙二醇攪拌2小時(shí)終止反應(yīng)。然后加入5克氯化鈉和1升乙醇沉淀分離得到氧 化海藻酸鈉，反復(fù)溶解沉淀3次除去多余雜質(zhì)后再透析3天然后冷凍干燥得到高純度的氧化 海藻酸鈉。氧化度采用鹽酸羥胺法滴定測(cè)得為43.2%。
[0053] 0.5克氧化海藻酸鈉溶于30毫升蒸餾水中然后加入1.8克去鐵胺攪拌反應(yīng)，2小時(shí) 后加入與去鐵胺等摩爾的氰基硼氫化鈉，