控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生工程，特別涉及一種控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球的方法。
技術(shù)背景
[0002]曲霉屬絲狀真菌廣泛分布在谷物、空氣、土壤和各種物品上。比較常見的有黑曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉等。它們在生物技術(shù)發(fā)展過程中發(fā)揮了很大的作用，很多產(chǎn)品來自于絲狀真菌的初級和次級代謝產(chǎn)物。黑曲霉已經(jīng)用來生產(chǎn)檸檬酸和很多酶類，例如市場上常見淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、葡萄糖酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氧酶、半乳糖苷酶、木聚糖酶、柚苷酶、單寧酶、脂肪酶、植酸酶、蛋白酶、果膠酶等都可以從曲霉屬絲狀真菌中獲得。曲霉屬絲狀真菌可以根據(jù)培養(yǎng)基的不同而產(chǎn)不同種酶的組合，如纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶。美國食品和藥物管理局(FDA)已經(jīng)認(rèn)定多種來自曲霉屬絲狀真菌的產(chǎn)物是安全的，所以曲霉屬絲狀真菌的產(chǎn)物被廣泛用于食品級產(chǎn)品中。
[0003]在深層培養(yǎng)過程中曲霉屬絲狀真菌在一定條件下會形成菌絲球。絲狀真菌以菌絲球的形態(tài)生長有發(fā)酵液粘度低、傳質(zhì)好、產(chǎn)物產(chǎn)量高、菌體回收簡單等優(yōu)點。而且控制一定的菌絲球大小還可以進一步避免溶氧限制、提高產(chǎn)物產(chǎn)量、減低生物反應(yīng)器的能耗。所以控制絲狀真菌菌絲球的大小是一項重要的技術(shù)。絲狀真菌菌絲球還可以吸附廢水中的金屬離子、染料達到處理廢水的目的。絲狀真菌還可以和其它單細胞微生物共成球，例如黑曲霉和多種海藻共成球后形成簡單的收獲方法。利用菌絲球收獲的方法節(jié)約了單細胞微生物水處理在收獲時所需要的大型耗能設(shè)備，降低了成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的，就是為了提供一種控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球的方法。
[0005]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:一種控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]第一步、孢子的培養(yǎng)
[0007]將曲霉屬絲狀真菌接種到固體培養(yǎng)基上，在22°C -32°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48_240h，曲霉屬絲狀真菌形成孢子；
[0008]第二步、孢子懸浮液的制備
[0009]利用無菌水或者磷酸緩沖液洗滌孢子，得到孢子懸浮液，分裝到滅菌后的小管中，在2-6 °C下保存待用；
[0010]第三步、控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球
[0011]將孢子懸浮液接種到察氏培養(yǎng)基中，接種孢子濃度為7.23X10VL?8.68 X 18/L ;然后，置于旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:pH 3.0?8.0，溫度22-35°C，搖床轉(zhuǎn)速100-200rpm ;在察氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球。
[0012]所述曲霉屬絲狀真菌包括黑曲霉、米曲霉或構(gòu)巢曲霉。
[0013]所述固體培養(yǎng)基包括PDA瓊脂培養(yǎng)基、含2%瓊脂的察氏培養(yǎng)基或YPD固體培養(yǎng)基。
[0014]上述第三步在察氏培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間為48_168h。
[0015]所述察氏培養(yǎng)基的制作方法如下:取glucose 25.0g、NaN033.0g、K2HPO4L 0g、KCl
0.5g、MgS04.7Η20 0.5g 和 FeSO4.7Η20 0.0lg，加去離子水至 IL ;再用 lmol/L HCl 和 ImoI/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 為 5.5。
[0016]本發(fā)明在察氏培養(yǎng)基中通過控制培養(yǎng)條件培養(yǎng)曲霉屬絲狀真菌得到菌絲球，具有提高產(chǎn)量、提高傳質(zhì)、回收菌體簡單的優(yōu)點。絲狀真菌是一類能形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀菌絲體的真菌。曲霉屬絲狀真菌的菌絲在一定條件下可以在液體培養(yǎng)中相互纏繞，形成球狀或者橢圓形的菌絲球。來自黑曲霉、米曲霉多種代謝物(有機酸等)是美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的食品安全級產(chǎn)品。而且它在食品中有很長時間應(yīng)用歷史。曲霉屬菌絲球在pH 4-6時吸附Cu'Zn'Ni'其中，黑曲霉以菌絲球的方式發(fā)酵有利于檸檬酸的產(chǎn)生和其它多種代謝物的產(chǎn)生。絲狀真菌菌絲球的另外一個優(yōu)點是有利于菌體的收獲。菌絲球的直徑大多數(shù)在0.5cm以上，用簡單的篩子就可以收獲菌絲球，降低了收獲過程的成本。利用菌絲球收獲的方法節(jié)約了大型耗能設(shè)備，降低了成本，而且在污水處理過程中避免使用化學(xué)絮凝劑，減少了對環(huán)境的危害。本發(fā)明采用只含有葡萄糖為有機碳源的察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對黑曲霉的孢子濃度、培養(yǎng)基的初始pH、葡萄糖濃度進行了優(yōu)化。結(jié)果表明黑曲霉在培養(yǎng)24h時就可以形成清晰的菌絲球，且在隨后的時間內(nèi)，菌絲球一直保持穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)菌絲球裂解的現(xiàn)象。在察氏培養(yǎng)基中，黑曲霉在孢子濃度為7.23 X 103/L?3.62X 107/L、初始pH3.5?pH7.5之間都可以形成菌絲球。降低察氏培養(yǎng)基的葡萄糖濃度后，黑曲霉仍然可以形成菌絲球。以上的研究結(jié)果表明黑曲霉有較寬的菌絲球形成條件，為黑曲霉的廣泛應(yīng)用提供了便利。
【附圖說明】
[0017]圖1為不同孢子濃度對黑曲霉在察氏培養(yǎng)基中成球的影響；
[0018]圖2為孢子濃度對曲霉屬絲狀真菌在察氏培養(yǎng)基中的菌絲球的影響；
[0019]圖3為不同pH值對黑曲霉在察氏培養(yǎng)基中成球的影響；
[0020]圖4為不同孢子濃度的黑曲霉在察氏培養(yǎng)基中的菌絲球；
[0021]圖5為黑曲霉在不同葡萄糖濃度的察氏培養(yǎng)基中成球；
[0022]圖6為黑曲霉在不同葡萄糖濃度的察氏培養(yǎng)基中的菌絲球。
[0023]具體實施方法
[0024]下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。
[0025]實施例1
[0026]將黑曲霉接種到PDA瓊脂培養(yǎng)基上，在22°C _32°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96_144h后，絲狀真菌形成孢子。
[0027]利用無菌水洗滌絲狀真菌孢子，將得到的孢子懸浮液經(jīng)過顯微鏡計數(shù)后，分裝到滅菌后的小管中，存于2_6°C，待用。
[0028]將制備后的孢子懸浮液接種到察氏培養(yǎng)基中，生物量在孢子濃度為7.23X 13/L?8.68X 106/L。培養(yǎng)條件是:pH 5.5，溫度30°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，察氏培養(yǎng)基經(jīng)過72h培養(yǎng)后，孢子濃度對曲霉屬絲狀真菌在察氏培養(yǎng)基中生長的影響見圖1。隨著孢子濃度的增力口，生物量逐漸增加。生物量在孢子濃度為4.34X 106/L?8.68X 106/L之間獲得較高的生物量(14.27g/L?15.70g/L)。培養(yǎng)液中的殘余糖濃度在9.61g/L?7.61g/L之間波動。孢子濃度為7.23X 103/L?7.23X 104/L之間時，pH值隨著孢子濃度的升高下降的更加劇。孢子濃度繼續(xù)升高時，最終PH變化不明顯(pH3.15?pH3.30)。黑曲霉在本實驗的孢子濃度范圍內(nèi)均可以形成菌絲球(圖2)。
[0029]實施例2
[0030]將米曲霉接種到含2%瓊脂的察氏培養(yǎng)基上，在22°C _32°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24_72h，絲狀真菌形成孢子。
[0031]利用磷酸緩沖液洗滌絲狀真菌孢子，將得到的孢子懸浮液經(jīng)過顯微鏡計數(shù)后，分裝到滅菌后的小管中，存于2-6°C，待用。
[0032]將制備后的孢子懸浮液接種到察氏培養(yǎng)基中，接種孢子濃度為7.23X10S/L。溫度30°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，經(jīng)過72h培養(yǎng)后。初始pH對黑曲霉在察氏培養(yǎng)基中的生長情況見圖3。在初始pH3.5?pH5.6之間，生物量隨著初始pH值的增大而逐漸升高。而初始pH高于5.6時，生物量略有下降，說明初始pH超過5.6對細胞生長有微弱抑制。初始pH越高，PH下降的幅度越大。初始pH3.5?pH6.5時察氏培養(yǎng)基中殘余葡萄糖的含量波動很小(8.79g/L?9.73g/L)。當(dāng)初始pH7.5時，殘余葡萄糖升高到11.31g/L。這和生物量下降的結(jié)果相符。圖3是黑曲霉在不同初始pH的條件下，經(jīng)過72h的培養(yǎng)形成的菌絲球。由圖4可以看出黑曲霉在初始PH3.5?pH7.5之間都可以形成菌絲球。
[0033]實施例3
[0034]將深黃被孢霉接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，在22°C _32°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)168_240h，絲狀真菌形成孢子。
[0035]利用無菌水滌絲狀真菌孢子，將得到的孢子懸浮液經(jīng)過顯微鏡計數(shù)后，分裝到滅菌后的小管中，存于2-6°C，待用。
[0036]將制備后的孢子懸浮液接種到豆制品廢水第一次處理的上清中，接種孢子濃度為7.23X10S/L。培養(yǎng)條件是:pH 5.5，溫度30°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，經(jīng)過72h培養(yǎng)后，絲狀真菌形成菌絲球。葡萄糖含量對黑曲霉在察氏培養(yǎng)基中生長情況見圖5。隨著葡萄糖含量的升高，生物量和殘余普通糖增加。葡萄糖含量為0.lg/L時，pH沒有下降。葡萄糖含量由0.1g/L增加到5.0g/L時，pH下降幅度逐漸加大。葡萄糖含量高于5.0g/L后，最終pH保持恒定(3.70左右)。圖5是黑曲霉在不同葡萄糖濃度時形成的菌絲球。圖6表明黑曲霉可以在Og/L?30g/L葡萄糖濃度內(nèi)形成菌絲球，培養(yǎng)液也保持澄清。
【主權(quán)項】
1.一種控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球的方法，其特征在于，包括以下步驟: 第一步、孢子的培養(yǎng) 將曲霉屬絲狀真菌接種到固體培養(yǎng)基上，在22°c -32°c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-240h，曲霉屬絲狀真菌形成孢子； 第二步、孢子懸浮液的制備 利用無菌水或者磷酸緩沖液洗滌孢子，得到孢子懸浮液，分裝到滅菌后的小管中，在2-6 °C下保存待用； 第三步、控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球 將孢子懸浮液接種到察氏培養(yǎng)基中，接種孢子濃度為7.23X 105/L?8.68X 18/L ;然后，置于旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:pH 3.0?8.0，溫度22-35°C，搖床轉(zhuǎn)速100-200rpm ;在察氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球的方法，其特征在于，所述曲霉屬絲狀真菌包括黑曲霉、米曲霉或構(gòu)巢曲霉。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球的方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基包括PDA瓊脂培養(yǎng)基、含2%瓊脂的察氏培養(yǎng)基或YPD固體培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球的方法，其特征在于，第三步在察氏培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間為48-168h。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球的方法，其特征在于，所述察氏培養(yǎng)基的制作方法如下:取 glucose 25.0g、NaNO3 3.0g、K2HPO4 1.0g, KCl 0.5g、MgSO4.7Η20 0.5g 和 FeSO4.7Η20 0.0lg，加去離子水至 IL ;再用 lmol/L HCl 和 lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為5.5。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球的方法。該方法包括孢子的培養(yǎng)、孢子懸浮液的制備和控制曲霉屬絲狀真菌形成菌絲球等步驟。絲狀真菌以菌絲球方式存在有易于傳質(zhì)、發(fā)酵液粘度低、產(chǎn)物產(chǎn)量高等優(yōu)點，而且菌絲球易于收獲其它單細胞微生物。本發(fā)明中控制條件包括孢子濃度、pH、培養(yǎng)基中糖濃度三個方面。本發(fā)明可以有效控制菌絲球的形成條件，為絲狀真菌菌絲球的廣泛應(yīng)用提供可靠方法。
【IPC分類】C12R1/685, C12R1/69, C12R1/66, C12N1/14
【公開號】CN105505781
【申請?zhí)枴緾N201410558748
【發(fā)明人】張建國, 沈建華, 黃勛娟, 傅堯娟, 李立, 袁輝
【申請人】上海理工大學(xué), 上海清美綠色食品有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2014年10月20日