寄生于蒙古黃榆上粗毛纖孔菌的固體培養(yǎng)基和栽培料最佳配方的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了寄生于蒙古黃榆上的粗毛纖孔菌的固體培養(yǎng)基及栽培料的最佳配 方。
【背景技術(shù)】
[0002] 粗毛纖孔菌Inonotus hispidus(Bull · )P.Karst.俗名粗毛黃孔菌，是一種生長在 溫帶的木腐菌，桑黃中的一種，主要生長在活立木上，偶爾生長在倒木上。曾用名粗毛黃褐 孔菌Xanthochrous hispidus，隸屬于擔(dān)子菌門Basidiomycota，傘菌綱Agaricomycetes，繡 革孔菌目Hymenochae tales，繡革孔菌科Hymenochaetaceae，纖孔菌Inonotus子實體于夏季 和秋季出現(xiàn)，晚秋后變黑，主要寄生在水曲柳Fraxinus mandschurica Rupr.、榆樹Ulmus pumila L·、桑樹 Morus alba L·、蘋果樹 Malus pumila Mill.和日本槐 Sophora japonica Linn.等闊葉樹，東北地區(qū)主要寄生在水曲柳上，西北地區(qū)在桑樹上常見;部分專家認(rèn)為粗 毛纖孔菌屬于桑黃中的一種，而桑黃最早記載于《本草綱目》中。中醫(yī)認(rèn)為桑黃性甘，平，味 苦，味辛，歸肝，膀胱經(jīng)。本品辛行甘和，入血分以化瘀，瘀血循經(jīng)而行出血止，有化瘀之功 效，用于血崩，血淋，脫肛瀉血，帶下，閉經(jīng)等疾?。挥捎谌藗儗ζ錈o節(jié)制的采摘，導(dǎo)致粗毛纖 孔菌資源越來越匱乏且其野生子實體生長周期慢、腐蝕活木，寄生于蒙古黃榆上的粗毛纖 孔菌在馴化栽培方面的研究未見報道，為此本專利首次對該粗毛纖孔菌進(jìn)行研究，旨在找 出其固體培養(yǎng)基和栽培料的最佳工藝，為大量人工栽培粗毛纖孔菌奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明公開了粗毛纖孔菌固體培養(yǎng)基和栽培料的最佳配方；
[0004] 1材料與方法
[0005] 1 · 1材料
[0006] 粗毛纖孔菌Inonotus hispidus菌株、葡萄糖、酵母浸粉等；
[0007] 1.2儀器
[0008] 高溫高壓滅菌鍋;超凈工作臺；電子計數(shù)天平(MARK MW3型），常熟市金羊砝碼儀器 有限公司;培養(yǎng)皿等；
[0009] 2實驗內(nèi)容與方法
[0010] 1.2方法
[0011] 1.2.1菌種活化:采用PDA加富培養(yǎng)基對粗毛纖孔菌菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)；
[0012]加富PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蛋白胨lg，KH2P〇4〇.6g， MgS〇4 · 7H2〇 0.6g，蒸餾水 l，000mL，pH自然；
[0013] 1.2.2不同溫度培養(yǎng)基篩選：以GPY培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，滅菌后將直徑為0.8cm 的菌餅接入至供試培養(yǎng)基，將其分別移入到15°C、20°C、25°C、30°C、35°C和40°C的6個梯度 的生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，接種Id后開始每天固定時間用劃線法測量菌絲直徑、觀察菌絲 長勢、菌落形狀和色素產(chǎn)生情況，待有菌絲直徑長至6cm左右且能清晰的看見菌絲邊緣后停 止記錄;GPY培養(yǎng)基:酵母浸粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，MgS〇4· 7H20 0.5g，KH2P〇4 lg，瓊 脂25g，蒸餾水l，000mL;
[0014] 1.2.3不同初始pH培養(yǎng)基篩選試驗：以GPY培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，供試培養(yǎng)基滅 菌前用0.2mol/L Na2HP〇4 · 2H20和0.1mol/L檸檬酸，用二者適量混合配置成8個pH梯度即： 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5共8個梯度，每個處理重復(fù)10次。滅菌后將直徑為 0.8cm的菌餅接入供試培養(yǎng)基，將其移入生化培養(yǎng)箱內(nèi)30°C條件下恒溫培養(yǎng)，接種Id后開始 每天固定時間用劃線法測量菌絲直徑、觀察菌絲長勢、菌落形狀和色素產(chǎn)生情況，待有菌絲 直徑長至6cm左右且能清晰的看見菌絲邊緣后停止記錄；
[0015] GPY培養(yǎng)基制作方法同1.2.2
[0016] 1.2.4不同碳源培養(yǎng)基篩選試驗:在無碳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加入20g果糖 (7.99 8/1)、木糖(7.998/1)、可溶性淀粉(7.998/1)、葡萄糖(7.26 8/1)、麥芽糖(7.998/1)、 蔗糖(8.41g/L)和乳糖(7.99g/L)作為碳源篩選試驗的7種不同水平，每個處理重復(fù)10次并 以無碳培養(yǎng)基作為對照，滅菌后將直徑為〇. 8cm的菌餅接入供試培養(yǎng)基，將其移入生化培養(yǎng) 箱內(nèi)30°C條件下恒溫培養(yǎng)，接種Id后開始每天固定時間用劃線法測量菌落直徑、觀察菌絲 長勢、菌落形狀和色素產(chǎn)生情況，待有菌絲直徑長至6cm左右且能清晰地看見菌絲邊緣后停 止記錄；
[0017]無碳培養(yǎng)基：酵母浸粉28，1(冊〇428，1%3〇4.7!120 18，瓊脂2(^、蒸餾水1，00〇1111^!1 自然；
[0018] 1.2.5不同氮源培養(yǎng)基篩選試驗:在無氮培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加入2g酵母 浸粉(0.29g/L)、蛋白胨(0.29g/L)、牛肉膏(0.26g/L)、L-谷氨酸(0.19g/L)、硝酸鉀(0.27g/ L)、脲(0.93g/L)和硝酸銨(0.69g/L)作為氮源篩選試驗的7種不同水平，每個處理重復(fù)10次 并以無氮培養(yǎng)基作為對照，滅菌后將直徑為〇. 8cm的菌餅接入供試培養(yǎng)基，將其移入生化培 養(yǎng)箱內(nèi)30°C條件下恒溫培養(yǎng)，接種Id后開始每天固定時間用劃線法測量菌落直徑、觀察菌 絲長勢、菌落形狀和色素產(chǎn)生情況，待有菌絲直徑長至6cm左右且能清晰地看見菌絲邊緣后 停止記錄；
[0019]無氮培養(yǎng)基：葡萄糖2(^，1(賊〇428，1%3〇4.7!120 18，瓊脂2(^、蒸餾水1，00〇1111^!1 自然；
[0020] 1.2.6正交試驗:對以上溫度、PH、碳源和氮源四個單因素進(jìn)行篩選，從各因素篩選 出3個水平進(jìn)行四因素三水平的正交試驗。在正交基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上按照正交表進(jìn)行不 同培養(yǎng)基的制作，滅菌前用lmol/L HCL和lmol/L NaOH調(diào)節(jié)相應(yīng)的pH值，將0.8cm的菌餅接 入相應(yīng)的培養(yǎng)基中，分別移入相應(yīng)的生化培養(yǎng)箱中按照相應(yīng)溫度恒溫培養(yǎng)，接種Id后開始 每天固定時間用劃線法測量菌絲直徑、觀察菌絲長勢、菌落形狀和色素產(chǎn)生情況，待有菌絲 直徑長至6cm左右且能清晰地看見菌絲邊緣后停止記錄；
[0021 ] 正交試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基:MgS〇4 · 7H20 0.5g，KH2P〇4 lg，瓊脂20g，蒸餾水lOOOrnL; [0022] 1.2.7最佳栽培料的篩選:設(shè)計了三種栽培種培養(yǎng)料配方進(jìn)行試驗對比，通過實驗 結(jié)果篩選出三種配方中較好的配方，三種配方如下：
[0023] A:木肩76%，稻殼2%，玉米粉4%，麩皮15%，蔗糖1%，石灰1%，石膏1%，含水量 60-62% ；
[0024] B:木肩78%，稻殼2%，玉米粉17%，蔗糖1%，石灰1%，石膏1%，含水量60-62% ; [0025] C:木肩77%，麥麩20%，石灰1%，石膏1%，蔗糖1%，含水量60-62% ;
[0026]實驗前一晚，將木肩稻殼和麩皮，比例稱量，潤濕一晚。次日按上述配方的不同比 例加入玉米粉、蔗糖、石灰和石膏。攪拌均勻后裝入17cmX 33cm規(guī)格的聚丙烯袋中，培養(yǎng)料 的緊實度要適中，裝袋高度約為14.5cm，重量約為0.65kg，將塑料打孔棒插入菌袋中心。每 個處理重復(fù)20個。裝袋完成后，放入高溫高壓滅菌鍋內(nèi)，121°C條件下滅菌2h。滅菌完成后放 入超凈工作臺中紫外滅菌，冷卻后進(jìn)行接種，接種過程中將塑料打孔棒撥出，接入長滿菌絲 的以高粱為基質(zhì)的原種，然后塞入滅過菌的脫脂棉，移入出菇室中26-28°C條件下培養(yǎng)。記 錄菌絲長勢，色素產(chǎn)生情況和菌絲長滿菌袋的天數(shù)，并根據(jù)相應(yīng)文章查詢出木肩、稻殼、玉 米粉、麥麩和蔗糖的含碳量和含氮量，對以上A、B和C配方的碳氮比進(jìn)行對比分析；
[0027] 3結(jié)果與分析
[0028] 2.1溫度試驗
[0029] 在不同培養(yǎng)溫度下，粗毛纖孔菌的菌落直徑呈現(xiàn)出不同的生長狀況（圖1)，培養(yǎng)第 14天時，以30°C為培養(yǎng)條件的粗毛纖孔菌菌落直徑大于同期培養(yǎng)在其他溫度下的菌落直 徑;在15°C-40°C的培養(yǎng)范圍內(nèi)，粗毛纖孔菌的菌絲均能生長，隨著溫度升高，其菌絲的生 長速度加快，但當(dāng)溫度過高時，反而抑制了菌絲的生長，40°C條件下培養(yǎng)的菌絲生長速度最 低；差異顯著性檢測結(jié)果表明，30°C和35°C對菌落直徑的影響差異的顯著性明顯小于兩者 與其他溫度處理間的差異顯著性；因此，該菌菌絲的適宜生長溫度范圍為30°C-35°C;
[0030] 粗毛纖孔菌在不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)至第14天時的菌落直徑方差分析見表1，結(jié)果 表明，粗毛纖孔菌菌落生長速度在不同培養(yǎng)溫度下差異較顯著，詳見圖1;
[0031]表1溫度方差分析表
[0032] Table 1 Variance analysis of Inonotus hispidus colony growth under the conditions of different temperatures.
[0034] 2.2初始pH試驗
[0035] 在不同初始pH下，粗毛纖孔菌的菌落直徑也呈現(xiàn)出不同的生長狀況（圖2)，由圖可 以看出當(dāng)pH在5.0-8.0范圍內(nèi)變化時，菌落直徑差異較小，長勢基本相同。pH為7.0和7.5時 的菌落直徑與其他pH條件下的菌落直徑相比較小;pH為8.5時，菌落直徑最大，但菌絲前期 生長較慢，且菌落形狀略不規(guī)則。其后依次為pH5.5、pH5.0、pH6.5、pH6.0和pH6.0;綜合各因 素，在不同pH條件下，使粗毛纖孔菌菌絲生長旺盛色素產(chǎn)生狀況較好的條件