奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)coi基因的擴(kuò)增引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，設(shè)及奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)C0I基因的 擴(kuò)增引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 反當(dāng)動(dòng)物胃腸道寄生線蟲(chóng)（gastrointestinal nematodes in ruminants)包括毛 圓線蟲(chóng)科（Trichostrongyloidae)中毛圓線蟲(chóng)亞科（Trichostrongylinae) W及長(zhǎng)刺線蟲(chóng) 亞科（Mecistocirrinae)動(dòng)物線蟲(chóng)。運(yùn)其中，毛圓線蟲(chóng)亞科奧斯特線蟲(chóng)屬（Ostertagia)、馬 歇爾線蟲(chóng)屬（Marshallagia)、背帶線蟲(chóng)屬（Teladorsagia)、血矛線蟲(chóng)屬（Haemonchus)、古 柏線蟲(chóng)屬（Cooperia)、毛圓線蟲(chóng)屬（Trichostrongylus)等6個(gè)屬對(duì)我國(guó)北方牧區(qū)的放牧 家畜危害較大，尤W奧斯特線蟲(chóng)、馬歇爾線蟲(chóng)危害嚴(yán)重。奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)屬于消化 道內(nèi)寄生蟲(chóng)，主要寄生于反當(dāng)動(dòng)物家畜第四胃（真胃）W及腸道的權(quán)皺中。上述寄生蟲(chóng)每 年對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)造成重大損失，其主要分為W下兩個(gè)方面：其一為反當(dāng)動(dòng)物感染胃部線蟲(chóng) 后，由于機(jī)體營(yíng)養(yǎng)被奪取及有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，影響畜產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量，極端情況會(huì)導(dǎo)致動(dòng) 物死亡，因此造成大量損失；另一方面，為了防治牛羊胃腸道線蟲(chóng)，定期驅(qū)蟲(chóng)消耗的藥品產(chǎn) 生的費(fèi)用。
[0003] 我國(guó)目前發(fā)現(xiàn)的馬歇爾線蟲(chóng)共有許氏馬歇爾線蟲(chóng)（Marshallagia hsui)、蒙古馬 歇爾線蟲(chóng)（Marshallagia mongolica)等9種；奧斯特線蟲(chóng)有達(dá)荷奧斯特線蟲(chóng)（Ostertagia d址urica)、布里亞特奧斯特線蟲(chóng)（Ostertagia buriatica) W及西方奧斯特線蟲(chóng) (Ostertagia occidentalis)等15種。反當(dāng)動(dòng)物奧斯特線蟲(chóng)、馬歇爾線蟲(chóng)的分類依據(jù)主要 是基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)，借助顯微鏡觀察雄性線蟲(chóng)的交合刺、導(dǎo)刺帶、交合傘等器官的形狀、 長(zhǎng)度、大小W及雌蟲(chóng)的陰口構(gòu)造，結(jié)合蟲(chóng)體本身的大小、長(zhǎng)度、顏色，W此鑒定蟲(chóng)種。但是，依 靠形態(tài)學(xué)鑒定線蟲(chóng)種類容易出現(xiàn)問(wèn)題：首先，許多動(dòng)物線蟲(chóng)樣本的形態(tài)特征在獲取標(biāo)本或 儲(chǔ)存時(shí)被破壞了；其次，全面掌握所有線蟲(chóng)種類的特征W及區(qū)分方法需要耗費(fèi)大量的時(shí)間， 而且十分困難；再次，某些不同種類反當(dāng)動(dòng)物奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)的形態(tài)特征近似，它 們之間的形態(tài)、大小極為相近，即使經(jīng)驗(yàn)豐富的專家也難W將它們區(qū)分；最后，奧斯特線蟲(chóng) /馬歇爾線蟲(chóng)不同種類的形態(tài)特征主要體現(xiàn)在雄蟲(chóng)上，其雌蟲(chóng)之間形態(tài)學(xué)差別較小，依據(jù)形 態(tài)學(xué)鑒定較為困難?；谏鲜鲈?，研發(fā)針對(duì)反當(dāng)動(dòng)物奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)的分子物 種鑒定方法勢(shì)在必行。
[0004] 近年來(lái)，利用分子技術(shù)對(duì)物種進(jìn)行鑒定和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究已經(jīng)成為一種快速有 效的方法，其中線粒體C0I基因5'端序列具有物種種間遺傳距離大，物種種內(nèi)序列保守、序 列兩端有保守序列可設(shè)計(jì)通用引物等特點(diǎn)成為物種鑒定和研究物種進(jìn)化關(guān)系的理想基因。 目前，已經(jīng)成為DNA條形碼值NA barcoding)技術(shù)在動(dòng)物類群中的標(biāo)準(zhǔn)基因。利用mtCOI 基因?qū)Ψ串?dāng)動(dòng)物奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)進(jìn)行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析具有很好的 前景。 W化]在實(shí)際研究中，使用化Imer等人于1994年設(shè)計(jì)的C0I通用引物L(fēng)C01490和 肥02198在反當(dāng)動(dòng)物奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)運(yùn)一類群中擴(kuò)增效率較低，阻礙了 DM條形碼 技術(shù)在上述的應(yīng)用。因此，奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)C0I基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與應(yīng)用，對(duì)利 用分子方法鑒定奧斯特線蟲(chóng)、馬歇爾線蟲(chóng)物種W及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析具有重要意義，同時(shí) 也能為反當(dāng)動(dòng)物胃腸道寄生蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾 線蟲(chóng)C0I基因的擴(kuò)增引物，其可W有效擴(kuò)增出通用引物L(fēng)C01490和肥02198不能擴(kuò)增的奧 斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)的C0I目的片段。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)C0I基因的 擴(kuò)增引物，其包括：
[0008] GNF :5'-ACTGCTCATGCTATTTTAA-3' ；
[0009] GNR :5'-GCCCACACMACACAACCAAT-3'。
[0010] 本發(fā)明還提供一種含有所述引物的用于檢測(cè)奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)的試劑盒。 W11] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2\PCR反應(yīng)緩沖液中的至 少一種。
[0012] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述引物或所述試劑盒在檢測(cè)奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)中的應(yīng) 用。
[0014] 本發(fā)明還提供了奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)的特異性PCR檢測(cè)方法，包括W下步 驟： 陽(yáng)〇1引 1)提取樣品DNA;
[0016] 。W步驟1)提取的DNA為模板，利用所述的引物GNF和GNR進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0017] 扣分析PCR產(chǎn)物。
[0018] 進(jìn)一步地，PCR反應(yīng)體系Κ20μ1 計(jì)為：2μΙ lOx Buffer，2yL DNTP(2mM)，l. 2μΙ MgCl2(25mM)，2μL引物GNF(10μM)，2μL引物GNR(10μM)，0.16μLr-Taq巧u/μL)，lμL DM模板，9.64 μ L雙蒸水。
[0019] 進(jìn)一步地，PCR反應(yīng)條件為：PCR擴(kuò)增程序：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30S，45°C 退火30S，72°C延伸Imin，共38個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min，4°C保存。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0021] 本發(fā)明提供的奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)C0I基因的擴(kuò)增引物，可W有效擴(kuò)增出通 用引物L(fēng)C01490和肥02198不能擴(kuò)增的奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)的C0I目的片段。滿足反 當(dāng)動(dòng)物奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)的物種分子鑒定需求，同時(shí)也能為奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線 蟲(chóng)種系發(fā)生關(guān)系研究、反當(dāng)動(dòng)物胃腸道寄生蟲(chóng)病防控提供可靠的分子技術(shù)指導(dǎo)。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明設(shè)計(jì)的奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)正向擴(kuò)增引物GNF序列與通用擴(kuò)增 引物L(fēng)C01490/肥02198擴(kuò)增的奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)C0I序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析的 結(jié)果；其中1 :GNF引物序列；2 :普通奧斯特線蟲(chóng)（Ostertagia ci;rcumcincta)COI序列；3 : 布里亞特奧斯特線蟲(chóng)（Ostertagia bu;riatica)COI序列；4:西藏奧斯特線蟲(chóng)（Ostertagia xizangensis)COI 序列；5 :西方奧斯特線蟲(chóng)（Ostertagia occidentalis)COI 序列；6 :許氏 馬歇爾線蟲(chóng)（Marshallagia hsui)C0I 序列；7 :矛形奧斯特線蟲(chóng)（Marshallagia lanceata) COI序列；8 :吳興奧斯特線蟲(chóng)（Marshallagia mihingensis)COI序列；9 :蒙古馬歇爾線蟲(chóng) (Marshallagia mongolica)COI 序列。
[0023] 圖2為本發(fā)明設(shè)計(jì)的奧斯特線蟲(chóng)/馬歇爾線蟲(chóng)反向擴(kuò)增引物GNR序列與獲取的普 通奧斯特線蟲(chóng)/布里亞特奧斯特線蟲(chóng)/奧氏奧斯特線蟲(chóng)/蒙古馬歇爾線蟲(chóng)C0I序列進(jìn)行 BLAST比對(duì)分析的結(jié)果，四條序列均為L(zhǎng)C01490/肥02198擴(kuò)增C0I序列的3'端側(cè)翼序列； 其中1 :GNR引物序列；2 :蒙古馬歇爾線蟲(chóng)序列；3 :普通奧斯特線蟲(chóng)序列；4 :奧氏奧斯特線 蟲(chóng)序列；5 :布里亞特奧斯特線蟲(chóng)序列。
【具體實(shí)施方式】
[0024] W下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。 陽(yáng)〇2引 實(shí)施例1
[00%] 1、樣品采集：于2011年~2014