一種提取頑拗植物組織dna的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于DNA提取技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種提取頑樹植物組織DNA的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA是基本遺傳物質(zhì)，是遺傳信息的載體。一定數(shù)量及高質(zhì)量的DNA樣品是進(jìn)行限 制性酶切、基因克隆、分子雜交、遺傳多態(tài)性分析W及基因組學(xué)等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。 因此，獲取高質(zhì)高量的DNA顯得極為重要。由于不同植物甚至是同一種類植物組織材料的來(lái) 源、部位、形態(tài)等外在性質(zhì)的不同W及化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)等內(nèi)在特點(diǎn)的差異，其DNA提取難 易程度存在明顯差異。從大多數(shù)的禾谷類及蔬菜類植物中提取DNA的難度就相對(duì)低于富含 多糖、多酪、單寧、色素等代謝物質(zhì)的木本植物。分子生物學(xué)家稱含有大量影響高質(zhì)量分離 的初生次生物質(zhì)的植物為頑樹植物，運(yùn)類植物有梨、柿子、龍眼等。如何去除運(yùn)些雜質(zhì)是頑 樹植物獲得高質(zhì)量的DNA面臨的主要問(wèn)題。
[0003] 我國(guó)梨樹栽培歷史悠久，資源豐富，栽培面積和產(chǎn)量一直居世界首位，梨也是我國(guó) 發(fā)展最迅速的水果之一，在國(guó)內(nèi)位居全國(guó)水果栽培總面積和總產(chǎn)量的第Ξ位。近些年，我國(guó) 科研工作者關(guān)于梨的分子生物學(xué)層面開展了眾多研究，2012年5月，世界首個(gè)梨全基因組序 列圖譜繪制也已經(jīng)完成。梨作為多年生木本果樹，其葉片、果皮等組織中富含多糖、酪類、單 寧和其他次生物質(zhì)，運(yùn)些次生物質(zhì)與DNA共沉淀，形成粘稠的膠狀物而難W溶解或產(chǎn)生褐 變;此外，梨果實(shí)水分含量大，尤其是成熟梨果肉組織DNA含量少?，F(xiàn)有傳統(tǒng)的CTAB法W及試 劑盒提取法對(duì)上述梨組織DNA的提取都存在不足之處:傳統(tǒng)CTAB及其改良方法操作繁瑣，且 獲得的DNA純度低，對(duì)上述梨組織DNA的提取量很有限，效率較低；試劑盒法僅適用于少量 DNA的提取。針對(duì)上述方法存在的不足，創(chuàng)新了一種提取梨組織DNA的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，在頑樹植物尤其是梨多種組織上進(jìn)行 DNA的提取時(shí)，提供一種既保證較高的DNA純度和濃度，又省時(shí)簡(jiǎn)便的DNA提取方法，W克服 上述【背景技術(shù)】中的缺點(diǎn)，提高DNA提取效率。
[000引本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題采用W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種提取頑樹植物組織DNA的方法，該方法所用抽提緩沖液是月桂酸鋼抽提緩沖 液;所述的月桂酸鋼抽提緩沖液，W500mL總量計(jì)，其配制方法是:稱取月桂酸鋼3~8g，氯化 鋼2.5~3.5g，加入50mL濃度為0.5~2mol · L-ip冊(cè).0的Tris-HCl緩沖液、15~35mL濃度為 0.5mol · L-ip冊(cè).0的邸TA、400血d地2〇，調(diào)節(jié)抑至8.0，d地2〇定容至500血，滅菌后室溫保存。
[0007] 所述的月桂酸鋼抽提緩沖液，W500mL總量計(jì)，其配制方法優(yōu)選:稱取月桂酸鋼5g， 氯化鋼2.925g，加入50mL濃度為Imol · L-ip冊(cè).0的Tris-Hcl、20mL濃度為0.5mol · L-ip冊(cè).0 的邸ΤΑ、400mLdd也0，調(diào)節(jié)pH至8.0，d地2〇定容至500mL，滅菌后室溫保存。
[0008] 所述的頑樹植物優(yōu)選自梨、柿子、龍眼;進(jìn)一步優(yōu)選梨。
[0009 ]本發(fā)明所述的一方法，優(yōu)選包含W下步驟：
[0010] (1)將梨組織樣品置于經(jīng)過(guò)液氮預(yù)冷的研鉢內(nèi)，迅速研磨至粉狀，研磨過(guò)程中防止 DNA被降解，期間應(yīng)不斷加入液氮。將研磨好的粉末移入抽提管中，加入月桂酸鋼抽提緩沖 液，反復(fù)緩慢的搖勻；
[0011] (2)加入與步驟（1)月桂酸鋼用量等體積的酪、氯仿和異戊醇混合液，再次反復(fù)緩 慢的搖勻后，4°C，12000rpm，離屯、15~20分鐘，吸取上清液;所述的酪、氯仿和異戊醇混合液 中酪、氯仿和異戊醇體積比為20~30:20~28:1;
[0012] (3)加入步驟(2)中吸取的上清液總體積的0.7倍異丙醇，上下緩慢顛倒數(shù)次，靜置 沉淀化W上，4°C，12000巧m，離屯、4~6分鐘，倒去上清液；
[0013] (4)70%~75% (體積百分比）的乙醇洗涂步驟(3)所得沉淀，反復(fù)輕輕震蕩洗涂，4 °C ,10000~1200化pm，離屯、5~10分鐘，棄上清，重復(fù)此步驟兩次；
[0014] (5)4°C ,10000~12000巧m，短暫離屯、20~30秒，吸干殘留乙醇；
[0015] (6)置于37°C烘箱，使乙醇揮發(fā)干凈；
[0016] (7)加入TE緩沖液，放置在恒溫箱溶解沉淀；
[0017] (8)待DNA完全溶解后，加入2~扣L的O.lmg ·血-iRNase，置于37°C烘箱30~60分鐘 消化RNA。
[0018] 步驟(1)中梨組織與月桂酸鋼提取緩沖液的用量關(guān)系進(jìn)一步優(yōu)選為：用2mLEP管提 取時(shí)，梨葉片、果皮組織可取0.1~0.2g，梨果肉組織因?yàn)樗侄啵?.5~0.6g:月桂酸鋼提 取緩沖液500~用50血抽提試管提取梨組織大片段DNA時(shí)，葉片、果皮組織可取2.5~ 5. Og，梨果肉組織可W取12.5~15. Og:月桂酸鋼提取緩沖液12~18mL。
[0019] 步驟(3)中加入的異丙醇用量?jī)?yōu)選為步驟(2)吸取的上清液總體積的0.5~0.7倍， 靜置時(shí)間為化W上;離屯、時(shí)的參數(shù)為:4°C，12000巧m，離屯、時(shí)間為4~6分鐘。
[0020] 步驟（7)中l(wèi)OOmL的TE緩沖液配制方法為：lmL的Imol · L-ipH = 8.0Tris-HCl緩沖 液、0.2mL的0.5mol · L-1抑= 8.0抓ΤΑ，加入約80mL dd出0均勻混合，用dd此明尋溶液定容到 lOOmL后，高溫高壓滅菌后室溫保存;根據(jù)自己需要的DNA濃度選取TE緩沖液的用量，小片段 提取時(shí)加 50~2(K)yL，大片段提取時(shí)加 300~lOOOyL恒溫箱溫度為65°C。
[00引]步驟(8)中RNase的用量為0.1 mg · mL-i的RNase加入2~扣L烘箱溫度為37°C，時(shí)間 為30~60分鐘。
[0022] 有益效果
[0023] (1)本發(fā)明中梨不同組織DNA提取方法中所用的提取緩沖液是月桂酸鋼提取緩沖 液，月桂酸鋼是一種陰離子表面活性劑，生物降解性很好，不僅有澄清去污作用，還可W促 進(jìn)沉降。月桂酸鋼可W很好地洗脫梨組織中存在的多糖、色素和多酪等次生物質(zhì)，使沉降的 DNA純度更高。
[0024] (2)采用本發(fā)明中的梨不同組織DNA提取的方法，樣本量和試劑用量成倍性關(guān)系， 可W根據(jù)自己需要的DNA的用途與樣品組織用量進(jìn)行換算，靈活變通，所W在對(duì)大量梨組織 DNA的提取上也可W適用。
[0025] (3)本發(fā)明中月桂酸鋼法提取步驟少，并且該方法不需要水浴，省時(shí)，操作簡(jiǎn)便，最 大程度地減小了提取過(guò)程中DNA的降解，DNA獲得率高、較為完整，能夠獲得大量且純度高的 DNA樣品。
[0026] (4)本發(fā)明在梨果肉0.6g左右樣品量中能提取到275.8雌/化的DNA濃度，在梨果皮 〇.15g左右樣品量中能提取到194.4ng/化的DNA濃度，在梨葉片O.lOg左右樣品量中能提取 到436.8叫/化的DNA濃度，并且OD260/280值都達(dá)到了 1.9W上（具體的數(shù)據(jù)見下表）。雖然用 CTAB法提取0. lOg梨葉片得到平均735. lng/化的DNA濃度，但是CTAB法提取的基因組DNA條 帶拖尾彌散，雜質(zhì)多，