ol/μレ短暫離屯、后備用;PCR擴(kuò)增采用Q5?熱啟動(dòng)超保真2X Master Mix(購(gòu) 自肥B公司，貨號(hào)M049化），反應(yīng)體系如表2所示。A輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1:98°C 3min;階段2:98°C 10s;階段3:72°C 3min;階段4:返回到階段2,24個(gè)循環(huán)；階段5:72°C 5min;階段6:25°C保溫。巢式B輪PCRWA輪PCR產(chǎn)物為模板，巢式B輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括： 階段 1:98°C 3min;階段2:98°C 10s;階段3:58°C 30s;階段4:72°C Imin;階段5:返回到階 段2,29個(gè)循環(huán);階段6:72°C5min;階段7:25°C保溫。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取2.0μLExoSAP-IT (購(gòu)自Affymetrix，貨號(hào)78205)和3. ΟμΙ dd出0，混勻，加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2. OyL，混勻微離屯、； 在PCR儀中進(jìn)行酶切反應(yīng)，程序:37°C，15 min; 80°C，15min; 4°C，保溫。
[0022] 表2、PCR試劑配制表格
3)配置SNaPshot PCR引物混合物，引物終濃度為0.8 pmol/yL，采用SNaPshot? Multiplex Kit(購(gòu)自ABI公司，貨號(hào)4323151)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表3所示。SP'JaPshot PCR反應(yīng)條件包括:階段1:96°C 10s;階段2:55°C 5s;階段3:60°C 30s;階段4:返回到階段 1，25個(gè)循環(huán);階段5:4°C保溫。
[0023] 表3、SNaPshot試劑配制表格
在挪aPshot PCR產(chǎn)物中加入1.化L SAP酶，按照W下程序進(jìn)行反應(yīng):37°C，15min; 80°C， 15min; 4°C，保溫。反應(yīng)完畢后，毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果采用GE肥MAPPERID V4.1軟件進(jìn)行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型，結(jié)果如圖3所示。
[0024] 實(shí)施例四、檢測(cè)CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的方法的特異性 本發(fā)明方法的特異性定義為陰性符合率。本發(fā)明對(duì)22例樣本進(jìn)行優(yōu)化挪aPshot測(cè)序法 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。挪aPshot測(cè)序法檢測(cè)出的陰性結(jié)果與Sanger 法顯示的結(jié)果相符(見(jiàn)表4)。本發(fā)明的檢測(cè)特異性為100%。
[00巧]表4、CYP2D6_G1661C檢測(cè)特異性試驗(yàn)數(shù)據(jù)
實(shí)施例五、檢測(cè)CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的方法的靈敏度 本發(fā)明方法的靈敏度定義為陽(yáng)性符合率。本發(fā)明對(duì)22例樣本進(jìn)行優(yōu)化挪aPshot測(cè)序法 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。挪aPshot測(cè)序法檢測(cè)出的陽(yáng)性結(jié)果與Sanger 法顯示的結(jié)果相符(見(jiàn)表5)。本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度為100% 表5、CYP2D6_G1661C檢測(cè)靈敏度
實(shí)施例六、檢測(cè)CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的方法的準(zhǔn)確度 本發(fā)明準(zhǔn)確度定義為不同方法檢測(cè)結(jié)果的一致性。本發(fā)明共對(duì)22例樣本進(jìn)行SNaPshot 巧賊法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。不同方法檢測(cè)結(jié)果一致，如表6所示。 本發(fā)明的準(zhǔn)確度為100%。
[0026] 表6、CYP2D6_G1661C基因 SNPs位點(diǎn)檢測(cè)準(zhǔn)確度
實(shí)施例屯、檢測(cè)CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的方法的精密度 本發(fā)明的精密度定義為對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)得到同一結(jié)果的能力。本發(fā)明進(jìn)行了人員 間、不同時(shí)間、不同儀器、同一標(biāo)本不同孔間的對(duì)比試驗(yàn)(見(jiàn)表7)，所有結(jié)果均顯示一致，本 發(fā)明精密度為100%。
[0027] 表7、批間精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)
w上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā) 明的具體實(shí)施只局限于運(yùn)些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫 離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的引物，其特征在于：包括巢式PCR擴(kuò)增引物和 SNaPshot PCR引物;所述巢式PCR擴(kuò)增引物包括巢式A輪PCR擴(kuò)增引物和巢式B輪PCR擴(kuò)增引 物;所述巢式A輪擴(kuò)增引物為:針對(duì)CYP2D6的上游引物5 ' - CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3 '和 下游引物5 ' - CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3 ' ；所述巢式B輪PCR擴(kuò)增引物為：針對(duì)CYP2D6_ -3'；所述SNaPshot PCR 引物為：針對(duì) CYP2D6_G1661C的 SNaPshot PCR 引物5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGAGCAGAGGCGCTTCTCCGT_ 3 '。2. -種CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于:包括如下步驟： S1提取DNA樣品； S2采用權(quán)利要求1所述的巢式A輪PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)A輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純 化； S3以巢式A輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板采用權(quán)利要求1所述的巢式B輪PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增； S4采用權(quán)利要求1所述的SNaPshot PCR引物進(jìn)行SNaPshot PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 純化； S5毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，確定SNP位點(diǎn)及其基因型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的方法，其特征在于:所述步 驟S1中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于:所述步 驟S2中的巢式A輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:98°C 3min;階段2:98°C 10s;階段3:72°C 3min;階段4:返回到階段2,24個(gè)循環(huán);階段5:72°C 5min;階段6:25°C保溫。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的方法，其特征在于:所述步 驟S3中的巢式B輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:98°C 3min;階段2:98°C 10s;階段3:58°C 30s;階段4:72°C lmin;階段5:返回到階段2,29個(gè)循環(huán)；階段6:72°C 5min;階段7:25°C保 溫。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于:所述步 驟S4中的SNaPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:96°C 10s;階段2:55°C 5s;階段3:60°C 30s;階段4:返回到階段1，25個(gè)循環(huán);階段5:4°C保溫。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于:所述步 驟S5中采用GENEMAPPERID V4.1軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的引物在制備檢測(cè)CYP2D6_G1661C 基因多態(tài)性試劑中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的引物及其檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的引物，包括巢式PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot？PCR引物；所述巢式PCR擴(kuò)增引物包括巢式A輪PCR擴(kuò)增引物和巢式B輪PCR擴(kuò)增引物。本發(fā)明提供的CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的引物具有特異性好，不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了CYP2D6_G1661C基因多態(tài)性的檢測(cè)，對(duì)實(shí)現(xiàn)基因?qū)蛐詡€(gè)體化治療，不斷提高治療效果、降低不良反應(yīng)具有非常重要的意義。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105506091
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511006947
【發(fā)明人】胡昌明, 梁耀銘, 于世輝, 趙薇薇, 燕啟江, 郭周萍
【申請(qǐng)人】廣州金域檢測(cè)科技股份有限公司
【公開(kāi)日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日