用于檢測il28b基因多態(tài)性的探針、基因芯片和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，具體的設及用于IL28B基因多態(tài)性檢測的探針、基因忍 片和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒化epatitis C virusJCV)引起的一種傳染 病。HCV感染是引起全球慢性肝病的主要原因之一，我國HCV感染率約為3.2%，每年新發(fā)丙 肝病例約3.5萬例。目前，丙型肝炎尚無有效疫苗預防感染。
[0003] 人IL28B基因位于染色體19ql3.13的AC011445.6基因群上，屬于ΙΠ 型干擾素家 族，編碼ΙΡΝ-λ3。IL28B基因由6個外顯子和5個內(nèi)顯子組成，含有由
[0004] 22個氨基酸組成的信號膚。研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎的治療與宿主的IL28B基因多態(tài)性 高度相關。IL28B基因的兩個多態(tài)性位點rsl2979860和rs8099917與丙型肝炎病毒患者的病 毒清除有顯著的相關性，即與丙肝患者標準化治療方案(聚乙二醇干擾素聯(lián)合利己韋林)的 抗病毒治療效果密切相關。
[0005] 隨著IL28B基因多態(tài)性臨床診斷價值的出現(xiàn)，市場上有各種檢測試劑盒誕生。如基 因測序、高分辨率溶解曲線法化igh-resolution melting analysis，HRM)、雜交探針法 化ybridization p;robe，HP)、TaqMan探針法、PCR等。其中，基因測序法操作繁瑣，工作量大 成本高;HRM法操作繁瑣，需用測序法對所得結果進一步確認且必須用特殊的儀器設備;HP 法成本較高；TaqMan探針法成本高，結果受化q酶活性影響較大，只能用于少量SNP位點分 析，需要特殊的儀器設備，不能發(fā)現(xiàn)未知SNP位點;PCR每次只能檢測一種突變要多管體系相 對應，存在操作不便的缺點。
[0006] 本發(fā)明采用的基因忍片進行檢測，其檢測通量大，在一張忍片上一次性完成兩個 位點多態(tài)性的檢測，結果更準確，具有檢測靈敏度高、特異性好，所需樣本量少等優(yōu)點。傳統(tǒng) 的基因忍片技術的檢測，是基于巧光標記探針的巧光發(fā)光來進行檢測的。其信號弱，必須經(jīng) 過激發(fā)，才能發(fā)光，需要昂貴的激光掃描設備。在臨床檢測應用過程中，由于檢測單位需要 投資購置激光掃描設備，一方面，顯著增加了進行相關檢測的投資成本，另一方面，也直接 增加了應用成本，限制了該技術的市場應用與推廣。本發(fā)明可通過生物忍片的可見光光學 放大，做到了信號分辨率高，信號可W用普通數(shù)碼相機拍照或肉眼直接判讀。相對傳統(tǒng)巧光 標記具有良好的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術不足，提供一種快速準確、結果直觀的IL28B基 因多態(tài)性檢測的基因忍片和試劑盒。
[000引為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案為：
[0009] -組用于IL28B基因多態(tài)性檢測的探針，包括rsl2979860和rs8099917位點的探 針;所述探針序列為：
[0010] rsl2979860-C 探針：TATTTGTTGGGGTAATCAACTGTT;
[0011] rsl2979860-T 探針：TATTTGCTGGGGAAACCACTTGTT;
[0012] rs8099917-T探針：CATTTGTTGGGGTAACCAACTATT;
[0013] rs8099917-G 探針：TGTTTGCTGGCATAATCAATTATT。
[0014] 進一步地，本發(fā)明的內(nèi)容還包括用于IL28B基因多態(tài)性檢測的基因忍片，其特征在 于，所述基因忍片包括固體相和權利要求1所述探針。
[0015] 進一步地，本發(fā)明的內(nèi)容還包括用于IL28B基因多態(tài)性檢測的基因忍片試劑盒，其 特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述探針或權利要求2所述基因忍片。
[0016] 進一步地，所述基因忍片試劑盒還包括W下引物對：
[0017] rsl2979860 引物對：
[001 引上游通用引物FP1:5 ' -CGCGATGCCCCGGGCCACG-3 ' ；
[0019]下游通用引物RPl:5'-Bio GGTCACCGCCCAGCCCCTGTG-3'；
[0020] rs8099917 引物對：
[0021] 上游通用引物FP2:5 ' -CACCATCCTCCTCTCATCCCTC-3 ' ；
[0022] 下游通用引物RP2:5'-Bio GCCAGCTACCAAACTGTATAC-3'。
[0023] 進一步地，所述引物上含有有生物素標記。
[0024] 進一步地，所述基因忍片試劑盒還包括PCR反應體系、陰性對照品、陽性對照品、雜 交緩沖液、洗涂液、BW反應液和TMB顯色液。
[0025] 進一步地，所述陽性對照品為9860-Τ，9917-Τ型樣本濃度106-10 9copies/ml，所述 陰性對照品為生理鹽水。
[00%]進一步地，所述雜交緩沖液為巧樣酸Ξ鋼0.3M、氯化鋼3M、十二烷基硫酸鋼0.3M、 Triton X-1000.1 %水溶液。
[0027]進一步地，所述洗涂液分為洗涂液A和洗涂液B，所述洗涂液A為0.01-0.1N化0H溶 液，所述洗涂液B為0.1 X SSC溶液。
[002引進一步地，所述BW反應液為用20 X SSC緩沖液將HRP標記的親合素稀釋到1:5000~ 1:10000。
[0029] 為了更好地理解和實施，下面詳細說明本發(fā)明。
[0030] 本發(fā)明通過特異性的引物和探針的選擇，結合基因忍片技術，不僅提高了檢測效 率和準確度。
[0031] 本發(fā)明通過PCR技術對病原體DNA進行擴增，擴增產(chǎn)物與生物忍片上的寡核巧酸探 針進行雜交，通過通過生物素標記，顯色液進行顯色后，直觀的表現(xiàn)檢測結果。
[0032] 本發(fā)明的基因忍片試劑盒，通過生物忍片的可見光光學放大，做到了信號分辨率 高，信號可W用普通數(shù)碼相機拍照或肉眼直接判讀。相對傳統(tǒng)巧光標記具有良好的效果。為 了更好地理解和實施，下面結合附圖詳細說明本發(fā)明。
【附圖說明】
[0033] 圖1是本發(fā)明采用基因忍片對人工合成的核酸鏈對應包含有待檢測的特異性基因 序列的9860CC質(zhì)粒，9860TT質(zhì)粒，9917TT質(zhì)粒，9917GG質(zhì)粒進行擴增和檢測結果。
[0034] 圖2A、B、C、D、E分別對不同濃度9860CC質(zhì)粒擴增和陰性樣品雜交檢測結果。
[00巧]圖3A、B、C、D、E分別對不同濃度9860TT質(zhì)粒擴增和陰性樣品雜交檢測結果。
[0036] 圖4A、B、C、D、E分別對不同濃度9917TT質(zhì)粒擴增和陰性樣品雜交檢測結果。
[0037] 圖5A、B、C、D、E分別對不同濃度9917GG質(zhì)粒擴增和陰性樣品雜交檢測結果。
[003引圖6為9860CC、9860TT、9917TT和9917GG四種樣本提取DNA后雜交檢測結果。
[0039] 圖7A、B、C、D、E、F為6組基因型為9860CC的標本提取DNA后雜交檢測結果。
[0040] 圖8A、B、C、D、E、F為6組基因型為9860TT的標本提取DNA后雜交檢測結果。
[0041 ] 圖9A、B、C、D、E、F為6組基因型為9917TT的標本提取DNA后雜交檢測結果。
[0042] 圖10A、B、C、D、E、F為6組基因型為9917GG的標本提取DNA后雜交檢測結果。
【具體實施方式】
[0043] 【實施例1】忍片和檢測試劑盒的制備
[0044] 基因忍片：按真空氣相沉淀法鍛膜，使用旋轉真空鍛膜機在厚度約為2.5mm，直徑 20cm娃片（Si〇2)上鍛上475埃的氮化娃及135埃的TSPS的薄膜，制備出相應的生物傳感器， 并覆蓋150埃的多聚苯丙氨酸-賴氨酸涂層，最后經(jīng)過1-lOuM鹽酸班巧酸酷亞胺基煙酸鹽處 理20分鐘，清水洗凈供忍片制作。將氨基修飾的探針，按照表1排列分別將探針點樣到處理 好的忍片上，探針序列如表2所示;每組設兩個平行點樣點：室溫下反應，制備出包含探針的 基因忍片。
[0045] 表1基因忍片探針點樣排列
[0048] 表2點樣的探針序列[0049]
[0046]
[0047]
[0050] 試劑盒:本實施例中試劑盒的組成如表3:
[0化1 ] 表3試劑盒組成
[0化2]
[0053]【實施例2】雜交反應過程
[0化4] 本實施例中基目標因片段rsl2979860(C/T)和rs8099917(T/G)如序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID ^.2所示。含有目標片段的質(zhì)粒9860(：(：質(zhì)粒，98601'1'質(zhì)粒，99171'1'質(zhì)粒， 99