17GG質(zhì)粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。化t-化q酶、加 TP、反轉(zhuǎn)錄擴增試劑、UNG 酶購自深圳菲鵬生物股份有限公司?；蛉唐瑸橹楹Ｙ悩菲嫔锛夹g(shù)有限公司提供，引物、 探針為英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成質(zhì)粒均為化g，將質(zhì)粒用1ml TE緩沖液溶解，質(zhì)粒 濃度為化g/ml即2000ng/ml。本實施例中，反應體系組成如表4，本實施例中引物序列如表5 所示。
[0055] 表4PCR反應體系
[0化6]

[0059] 將待檢測臨床樣本(進行DM提取0或人工合成的質(zhì)粒模板加入對應體系進行擴 增，加入量為化1，體系總體積為25ul;反應體系中加入UNG酶能夠去除擴增產(chǎn)物污染，減少 假陽性結(jié)果。
[0060] 將上述加入引物PCR反應混合液放入PCR儀進行PCR擴增。
[0061 ] PCR 過程:95°C 反應 lOmin; 94°C 變性 30s、56°C 復性 30s、72°C 延伸 30s，重復 40 個循 環(huán)；72°C 延伸 5min。
[0062] 將PCR擴增產(chǎn)物95°C加熱3分鐘，迅速置于冰上；
[0063] 取lOul PCR擴增產(chǎn)物至所制備生物忍片上；
[0064] 取lOOul雜交緩沖液于忍片上，在55°C反應60分鐘；
[0065] 用預熱的0.01-0.明船0田容液洗涂3次，每次5-103;
[0066] 將忍片置于50°C0.1XSSC中洗涂Imin，空氣吹干忍片表面；
[0067] 取BW反應液lOOul于忍片上，室溫反應10分鐘；
[006引用0.1 X SSC溶液清洗3次，每次1分鐘，空氣吹干忍片表面；
[0069] 取lOOul TMB顯色液于忍片表面，反應5分鐘；
[0070] 用0.1 X SSC溶液清洗3次，每次1分鐘，空氣吹干忍片表面，照相機拍照或肉眼閱讀 信號。
[007。 結(jié)果：利用實施例1制備的忍片分別對9860CC質(zhì)粒，9860TT質(zhì)粒，9917TT質(zhì)粒， 9917GG質(zhì)粒進行擴增和檢測，其結(jié)果如圖1所示，實施例1制備的基因忍片可W準確地對 S12979860和rs8099917的突變進行檢測。
[0072] 【實施例3】基因忍片靈敏度檢測結(jié)果
[0073] 1.樣品制備
[0074] 取含有目標片段的質(zhì)粒9860CC質(zhì)粒，9860TT質(zhì)粒，9917TT質(zhì)粒，9917GG質(zhì)粒，將各 種高濃度質(zhì)粒按照10倍進行梯度稀釋，稀釋得到質(zhì)粒濃度如表6:
[00巧]表6帶檢測質(zhì)粒濃度梯度
[0076]
[0077] 2.檢測
[0078] 按照實施例2的方法，利用制備的基因忍片分別對上述樣品進行檢測。
[00巧]3.結(jié)果
[0080] 9860體系加入9860CC質(zhì)粒擴增雜交結(jié)果如圖2所示:其中，圖A、B、C、D、E分別對應 9860CC-4、9860CC-5、9860CC-6、9860CC-7 和陰性樣品。
[0081 ] 9860體系加入9860TT質(zhì)粒擴增雜交結(jié)果如圖3所示:其中，圖A、B、C、D、E分別對應 9860TT-4、9860TT-5、9860TT-6、9860TT-7 和陰性樣品。
[0082] 9917體系加入9917TT質(zhì)粒擴增雜交結(jié)果如圖4所示:其中，圖A、B、C、D、E分別對應 9917TT-4、9917TT-5、9917TT-6、9917TT-7、陰性樣品。
[0083] 9917體系加入9917GG質(zhì)粒擴增雜交結(jié)果如圖5所示:其中，圖A、B、C、D、E分別對應 9917GG-4、9917GG-5、9917GG-6、9917GG-7、陰性樣品。
[0084] 結(jié)合W上檢測結(jié)果可W看出，該檢測方法，檢測靈敏度高，能夠檢測出2Xl(T6ng/ ul的模板，即檢測限為2 X l(T4ng/ul。
[0085] 【實施例4】基因忍片特異性檢測結(jié)果
[0086] 將四種樣本提取DNA后采用實施例2方法進行檢測，雜交得到結(jié)果如圖6,可W看 出，除了上文中對單獨病原體能準確檢出外，四種樣本混合存在情況下，也能準確檢出。
[0087] 【實施例5】基因忍片檢出率
[0088] 從臨床收集抓TA抗凝全血樣本，經(jīng)測序確認樣本基因型為9860CC、9860TT、9917TT 和9917GG各6組。采用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit(Cat.No.51104)提取全血 DM,每個全血標本提取洗脫核酸各50μ1。通過PCR擴增后進行雜交得到結(jié)果如圖7、8、9和10 所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的基因忍片可W對不同人樣本的S12979860和rs8099917的突變進 行正確檢驗和區(qū)分。
[0089] 本發(fā)明并不局限于上述實施方式，如果對本發(fā)明的各種改動或變形不脫離本發(fā)明 的精神和范圍，倘若運些改動和變形屬于本發(fā)明的權(quán)利要求和等同技術(shù)范圍之內(nèi)，則本發(fā) 明也意圖包含運些改動和變形。
【主權(quán)項】
1. 一組用于IL28B基因多態(tài)性檢測的探針，包括rsl2979860和rs8099917位點的探針； 所述探針序列為： rsl2979860-C 探針：TATTTGTTGGGGTAATCAACTGTT; rsl2979860-T 探針：TATTTGCTGGGGAAACCACTTGTT; 『88099917-1'探針：041176176666了440^40^1'1'; r s8099917-G 探針：TGTTTGCTGGCATAATCAATTATT。2. 用于IL28B基因多態(tài)性檢測的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括固體相和權(quán) 利要求1所述探針。3. 用于IL28B基因多態(tài)性檢測的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要 求1所述探針或權(quán)利要求2所述基因芯片。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述基因芯片試劑盒還包括以 下引物對： rsl2979860 引物對： 上游通用引物FP1:5 ' -CGCGATGCCCCGGGCCACG-3 ' ； 下游通用引物RPl:5'-Bio GGTCACCGCCCAGCCCCTGTG-3' ； rs8099917 引物對： 上游通用引物FP2:5 ' -CACCATCCTCCTCTCATCCCTC-3 ' ； 下游通用引物RP2:5'-Bio GCCAGCTACCAAACTGTATAC-3'。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述引物上含有有生物素標 記。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述基因芯片試劑盒還包 括PCR反應體系、陰性對照品、陽性對照品、雜交緩沖液、洗滌液、BW反應液和TMB顯色液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品為9860-T， 9917-T型樣本濃度106-10 9copies/ml，所述陰性對照品為生理鹽水。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述雜交緩沖液為檸檬酸三鈉 0.3M、氯化鈉3M、十二烷基硫酸鈉0.3M、Triton X-100 0.1%水溶液。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述洗滌液分為洗滌液A和洗 滌液B，所述洗滌液A為0.01 -0.1N NaOH溶液，所述洗滌液B為0.1 X SSC溶液。10. 據(jù)權(quán)利要求9所述的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述BW反應液為用20 X SSC緩沖 液將HRP標記的親合素稀釋到1:5000~1:10000。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，具體的涉及用于IL28B基因多態(tài)性檢測的探針、基因芯片和試劑盒。一組用于IL28B基因多態(tài)性檢測的探針，包括rs12979860和rs8099917位點的探針；所述探針序列為：rs12979860-C探針：TATTTGTTGGGGTAATCAACTGTT？SEQ？ID？NO.1；rs12979860-T探針：TATTTGCTGGGGAAACCACTTGTT？SEQ？ID？NO.2；rs8099917-T探針：CATTTGTTGGGGTAACCAACTATT？SEQ？ID？NO.3；rs8099917-G探針：TGTTTGCTGGCATAATCAATTATT？SEQ？ID？NO.4。本發(fā)明通過特異性的引物和探針的選擇，結(jié)合基因芯片技術(shù)，不僅提高了檢測效率和準確度。
【IPC分類】C12N15/11, C40B40/06, C12Q1/68
【公開號】CN105506122
【申請?zhí)枴緾N201610014807
【發(fā)明人】宋家武, 王麗玲, 肖杰, 熊珊珊, 郝永芬, 康啟鳴, 陳妙萍, 鐘宇萍
【申請人】珠海賽樂奇生物技術(shù)股份有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月8日