一種含有pfb-2引物對(duì)的豬糞便污染檢測(cè)試劑盒及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種豬糞便污染檢測(cè)試劑盒及其制備與 應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 當(dāng)今社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展快速，水體環(huán)境經(jīng)常被微生物污染，特別是飲用水受病原菌污 染后引發(fā)傳染性疾病日益嚴(yán)重。大部分腸道傳染病可通過(guò)水環(huán)境傳染，但是污染源很難確 定，污染致病菌難W準(zhǔn)確示蹤，運(yùn)些都是當(dāng)前常規(guī)的檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)方法不能完全解決的 問(wèn)題。因此，找到一個(gè)有效、快速、與污染源直接關(guān)聯(lián)的新指示菌指標(biāo)用來(lái)彌補(bǔ)當(dāng)前檢測(cè)的 不足是當(dāng)務(wù)之急。在中國(guó)環(huán)保局頒布的地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，糞便中的大腸桿菌 (Escherichia coli)菌落數(shù)是一個(gè)重要的指標(biāo)，運(yùn)是因?yàn)榧S便污染是水體污染的一個(gè)重要 因素之一。糞便中可能含有許多致病細(xì)菌，如大腸桿菌〇157、H7和沙口氏菌（Salmonella)， 原生動(dòng)物隱抱子蟲(chóng)（CiTptosporidium protozoan)，肝炎病毒（Hepadnavividae )。糞大腸 桿菌(Fecal col iform )、大腸桿菌和腸球菌(Enterococcus)能夠被全世界很多國(guó)家作為 水體污染的指示菌，是因?yàn)樗麄兊臋z測(cè)相對(duì)簡(jiǎn)單，比較符合糞便污染檢測(cè)指標(biāo)中對(duì)示蹤微 生物的要求，水體中運(yùn)些微生物的含量是反映水質(zhì)污染程度和水質(zhì)是否安全的重要指標(biāo)， 也是水體利用和污水治理的主要依據(jù)。大腸桿菌是最早作為糞便污染的指示微生物，隨后 糞大腸菌群、總大腸桿菌（TotaVfecal coliforms)、腸球菌屬、擬桿菌（Bacteroides)、產(chǎn) 氣芙膜梭菌(Clostridium perfringens )等腸道微生物相繼作為示蹤菌，運(yùn)些指示菌成 功示蹤了多起糞便污染水質(zhì)事故，為水污染的糞便來(lái)源追蹤提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。
[0004] 隨著養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，豬糞尿造成的環(huán)境污染也日益嚴(yán)重，豬糞尿中含有大 量的氮、憐、鐘，直接排放到水中會(huì)造成水體富營(yíng)養(yǎng)化。目前，水質(zhì)監(jiān)測(cè)的生物指標(biāo)為大腸桿 菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)，然而運(yùn)些指標(biāo)只能反映水體狀況，無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)控水體污染，也無(wú)法定位水 體污染源。
[000引因此，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)豬糞便污染是當(dāng)務(wù)之急。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種豬糞便污染檢測(cè)試劑 盒及其制備與應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 本發(fā)明的第一方面，提供一種豬糞便污染檢測(cè)引物對(duì)，包括正向引物和反向引物，所述 正向引物的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為:CCTTTGTCCTCAGTGAAGA;所述反向引物 的核巧酸序列如沈Q ID ^.2所示，具體為:1^66441701；口760：1'口'64了0：。
[0009] 本發(fā)明的第二方面，提供了前述豬糞便污染檢測(cè)引物對(duì)在制備豬糞便檢測(cè)試劑或 檢測(cè)試劑盒中的用途。
[0010] 本發(fā)明的第Ξ方面，提供一種豬糞便污染檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒含有前述豬糞 便污染檢測(cè)引物對(duì)。
[0011] 優(yōu)選地，所述試劑盒還含有對(duì)照引物對(duì)，所述對(duì)照引物對(duì)含有正向引物和反向引 物，所述正向引物的核巧酸序列如SEQ ID NO. 3所示，具體為:CTAACTACGTGCCAGCAGCC;所述 反向引物的如沈Q ID ^.4所示，具體為:60：口^60：4口'66了6口'0：。
[0012]本發(fā)明的試劑盒采用高靈敏性的PCR技術(shù)來(lái)進(jìn)行豬糞便化ecalibacterium菌的檢 巧。，采用所述豬糞便污染檢測(cè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增情況可分析來(lái)判斷豬糞便 化ecalibacterium菌感染情況。因此，引物對(duì)的設(shè)計(jì)是本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵。
[0013]基于本發(fā)明所述試劑盒采用的是PCR技術(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的，所W試劑盒中還可W包 括其他一些PCR所需要的常規(guī)試劑，如:Taq酶、PCR反應(yīng)緩沖液、MgCb、dNTPs等常用PCR反應(yīng) 試劑中的一種或多種。由于此類PCR常用試劑均可經(jīng)市場(chǎng)途徑單獨(dú)購(gòu)得或者自行配置，因此 具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可W根據(jù)客戶實(shí)際需要配置，為方便起見(jiàn)，也可全部裝 配入試劑盒。
[0014] 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中，引物、Taq酶、PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、dNTPs均為常見(jiàn)組分， 其含量亦為常規(guī)。
[0015] PCR擴(kuò)增反應(yīng)液可自行配置，也可直接W市售的不含引物的通用PCR擴(kuò)增反應(yīng)液加 入引物對(duì)獲得。例如，所述試劑盒中還可W含有2X化wer化q PCR Master Mix。加入本發(fā) 明的豬糞便污染檢測(cè)引物對(duì)即可獲得PCR擴(kuò)增反應(yīng)液。
[0016] 所述試劑盒中還可含有陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照含有化ecalibacterium菌保守序列， 可為含有。日日。日116日。*日'川111菌保守序列的質(zhì)粒。所述的陽(yáng)性對(duì)照也可^為滅活的 化6。日1化日(：161'；[加1菌培養(yǎng)液。還可采用現(xiàn)有化6。日1化日(3161'；[加1菌檢測(cè)試劑盒中的陽(yáng)性對(duì) 照，也可單獨(dú)市購(gòu)或根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)自行構(gòu)建。
[0017] 所述試劑盒中還可含有陰性對(duì)照。陰性對(duì)照可為各種不含有化ecal化acterium菌 的溶液，如PCR反應(yīng)緩沖液、無(wú)菌水(DEPC-出0)、生理鹽水等。
[0018] 本發(fā)明的第四方面，提供一種豬糞便污染檢測(cè)方法，其采用前述豬糞便污染檢測(cè) 引物對(duì)或前述豬糞便污染檢測(cè)試劑盒，包括如下步驟： (1)提取樣品基因組DNA; (2 )加樣:將樣品基因組DNA、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照分別加入裝有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的PCR 管中，獲得對(duì)應(yīng)的樣品反應(yīng)管、陽(yáng)性反應(yīng)管或陰性反應(yīng)管； (3) PCR擴(kuò)增:反應(yīng)管置于PCR儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (4) PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用擴(kuò)增產(chǎn)物分析結(jié)果。
[0019] 步驟（1)中，提取樣品基因組DNA為現(xiàn)有技術(shù)。優(yōu)選地，可采用M0-BI0化werSoil? DM Isolation kit提取樣品基因組DM。
[0020]優(yōu)選地，步驟(2)中，各反應(yīng)管中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的體積為15 uL，含樣品基因組 DNA luL，2XPower Taq PCR Master Mix,正向引物（10uM/L)0.5uL，反向引物（lOuM/L) 0.5uL，2X化wer Taq PCR Master Mix 7.加 L，無(wú)菌水補(bǔ)足至 15 uL。
[0021 ] 優(yōu)選地，步驟（3)中，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋侯A(yù)變性95°C/300s，1次循環(huán)；變性94°C/ 30s，延伸 60°C/30s，32 次循環(huán)。
[0022] 優(yōu)選地，步驟(4)中，將擴(kuò)增產(chǎn)物加 L用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析。
[0023] 本發(fā)明的第五方面，提供了前述試劑盒在制備豬糞便污染檢測(cè)產(chǎn)品中的用途。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明的豬糞便污染檢測(cè)引物對(duì)W及檢測(cè)試劑盒對(duì)豬糞便污染檢測(cè)特異性高達(dá)100%， 最低檢測(cè)限化OQs)為2.9拷貝數(shù)/反應(yīng)，陽(yáng)性率高達(dá)86%。采用所述引物對(duì)及試劑盒能夠快速 判定水體是否被污染，并定位污染源。
[0025]
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1:六個(gè)物種的擴(kuò)增產(chǎn)物加 L用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析所的結(jié)果。
[0027] 圖2:六個(gè)物種定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果。
[0028] 圖3:50個(gè)陽(yáng)性樣品中有43個(gè)樣品可W通過(guò)引物對(duì)PFB-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增并可看到明 顯條帶，其陽(yáng)性率為86%。
[0029]
【具體實(shí)施方式】
[0030] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案;還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定