用于Ion Proton測序平臺的TN5建庫的引物組、試劑盒和建庫方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及測序技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種用于Ion Proton測序平臺的TN5建庫的引 物組、試劑盒和建庫方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生命技術(shù)(Life Technologies)公司研發(fā)的Ion Proton?基因測序儀采用了新一 代半導(dǎo)體測序技術(shù)。該系統(tǒng)擁有快速、簡單及可擴展等特征，能有效推進臨床研究在癌癥及 遺傳性疾病等診斷中的發(fā)展。但是在上機文庫構(gòu)建中，依然需要傳統(tǒng)的DNA片段化、加接頭、 修復(fù)、片段選擇等操作，過程繁瑣，耗時較長。并且所需要的DNA起始量較高，不適合微量體 系（<10ng)建庫。雖然該公司在后期開發(fā)了基于MuA轉(zhuǎn)座子的MuSeek?文庫構(gòu)建試劑盒 (MuSeek?Library Preparation Kit)，但是依然需要較高的DNA起始量(>50ng)，并且試劑 中的酶需要存儲在_70°C冰箱中，使得一些小型、簡單的實驗室無法保存利用。
[0003] 高度活化變異的TN5轉(zhuǎn)座酶能夠隨機介導(dǎo)雙鏈DNA的片段化并短時間內(nèi)添加寡核 苷酸片段，這使得TN5能夠應(yīng)用于二代測序的文庫制備中。但是目前商品化的TN5轉(zhuǎn)座酶主 要應(yīng)用于Hiseq測序儀平臺中，illumina公司生產(chǎn)的Nextera DNA kits即是此類快速高效 制備文庫的代表。其它平臺未見其應(yīng)用。因此，亟需開發(fā)一種技術(shù)，使得TN5轉(zhuǎn)座酶能夠適于 Ion Proton?的文庫構(gòu)建。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種用于Ion Proton測序平臺的TN5建庫的引物組、試劑盒和建庫方 法，使得TN5轉(zhuǎn)座酶能夠高效、快速、微量的構(gòu)建適于Ion Proton的文庫，構(gòu)建的文庫可以直 接上機測序。
[0005] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種用于Ion Proton測序平臺的TN5建庫的 引物組，該引物組包括用于接頭包埋的SEQ ID N0:l-3所示的序列，以及用于PCR擴增的SEQ ID N0:4-5所示的序列。
[0006] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述引物組還包括用于PCR擴增的SEQ ID N0: 6-7所示的序列。
[0007] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述用于PCR擴增的SEQ ID N0:5所示的序列具 體包括:SEQ ID NO:8-23所示的序列。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種用于Ion Proton測序平臺的TN5建庫的 試劑盒，該試劑盒包括第一方面的引物組。
[0009] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括TN5轉(zhuǎn)座酶，任選地還包括用 于TN5轉(zhuǎn)座酶的緩沖液。
[0010] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述試劑盒還包括用于PCR擴增的聚合酶，任選 地還包括用于上述聚合酶的緩沖液。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種用于Ion Proton測序平臺的TN5建庫方 法，該方法包括:使用SEQ ID N0:1-3所示的序列與TN5轉(zhuǎn)座酶進行接頭包埋;使用得到的包 埋復(fù)合體對DNA進行片段化處理;使用SEQ ID N0:4-5所示的序列對片段化產(chǎn)物進行PCR擴 增；以及對PCR擴增產(chǎn)物進行純化。
[0012] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述方法還包括:在PCR擴增過程中還使用SEQ ID N0:6-7所示的序列。
[0013] 作為本發(fā)明的進一步改進的方案，上述SEQ ID N0:5所示的序列具體包括:SEQ ID NO :8-23所示的序列。
[0014] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述片段化處理的DNA的起始量是50ng以下。
[0 015 ]本發(fā)明提供的引物組，使得τ N 5轉(zhuǎn)座酶能夠高效、快速、微量的構(gòu)建適于I ο η Proton的文庫，構(gòu)建的文庫可以直接上機測序。本發(fā)明不僅摒棄了原始的復(fù)雜文庫構(gòu)建程 序，而且操作簡單，測序結(jié)果穩(wěn)定。文庫構(gòu)建可在lh內(nèi)完成，特別是DNA建庫起始量可以達到 納克級（l-l〇ng)，極大地促進了Ion Proton?基因測序儀的應(yīng)用和整體測序速度。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明一個實施方案的Ion Proton測序平臺的TN5建庫方法流程圖；
[0017] 圖2為本發(fā)明實施例1得到的文庫使用安捷倫2100生物分析儀檢測結(jié)果圖；
[0018] 圖3為本發(fā)明實施例1得到的文庫的基因表達數(shù)量檢測圖；
[0019] 圖4為本發(fā)明比較例1的引物組一得到的文庫使用安捷倫2100生物分析儀檢測結(jié) 果圖；
[0020] 圖5為本發(fā)明比較例1的引物組二得到的文庫使用安捷倫2100生物分析儀檢測結(jié) 果圖；
[0021] 圖6為本發(fā)明比較例1的引物組三得到的文庫使用安捷倫2100生物分析儀檢測結(jié) 果圖；
[0022] 圖7為本發(fā)明比較例1的引物組四得到的文庫使用安捷倫2100生物分析儀檢測結(jié) 果圖；
[0023] 圖8為本發(fā)明比較例1的引物組五得到的文庫使用安捷倫2100生物分析儀檢測結(jié) 果圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過【具體實施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0025] 發(fā)明人經(jīng)深入研究和篩選得到一組可以用于Ion Proton測序平臺的TN5建庫的引 物組，使用該組引物能夠使得TN5轉(zhuǎn)座酶高效、快速、微量的構(gòu)建適于Ion Proton的文庫，構(gòu) 建的文庫可以直接上機測序。
[0026]需要說明的是，在實際應(yīng)用中，需要經(jīng)過反復(fù)試驗篩選才能得到可用的引物，本發(fā) 明的發(fā)明人還嘗試使用其它序列作為引物用于Ion Proton測序平臺的TN5建庫，難以獲得 成功，而出乎意料地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的引物組不但能夠?qū)崿F(xiàn)基本的建庫功能，而且具有高效、快 速、微量的特點。
[0027]本發(fā)明的引物組包括表1所示的幾條引物，其中SEQ ID N0:l-5所示的引物為必需 引物，而SEQ ID N0:6-7為進一步可以包括的引物。在不包括SEQ ID N0:6-7的情況下，也能 實現(xiàn)基本的PCR擴增功能；而在包括SEQ ID NO:6-7的情況下，能夠?qū)崿F(xiàn)嵌套式PCR擴增功 能，增加敏感性和可靠性。
[0028]表 1
[0031] 表1中，SEQ ID N0:1-3所示的序列用于接頭包埋，其中Tn5-M是短接頭序列，而 Tn5-M-A-Ion和Tn5-M-P-Ion是長接頭序列，短接頭序列分別與兩條長接頭序列形成配對， 與TN5轉(zhuǎn)座酶包埋形成包埋復(fù)合體。
[0032] 本發(fā)明中，PCR擴增至少需要兩條引物序列，即IonAdapter-P和IonAdapter-A，其 中1〇1^0^七61-?是序列固定的序列，而1〇1^0^七61-六含有標簽(1^11'(3〇(16)序列"[；[-4]"，其 中標簽序列用于區(qū)分不同的樣本，因此也可以稱為"樣本標簽序列"。標簽序列可以采用目 前高通量測序中通用的標志（index)序列。一般只要能夠區(qū)分出樣本且不干擾測序即可，可 以是一段連續(xù)的隨機序列，長度一般大于6bp，比如8bp、10bp或12bp等。本發(fā)明一個實施例 中使用的標簽序列的長度是l〇bp，因此SEQ ID N0:5所示的IonAdapter-A序列中的[i-A]可 以是10個連續(xù)的隨機堿基，即"NNNNNNNNNN"，也就是說本發(fā)明中的SEQIDN0 :5所示的 IonAdapter-A序列可以表示為如下序列：
[0033] 57-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGATGCTGGCTGACGGGAT-3'。 [0034] 然而，應(yīng)當理解的是，本發(fā)明中SEQ ID N0:5所示的序列并不局限于標簽序列是 "NNNNNNNNNN"的序列，而是任何只要標簽序列互不相同、而其它部分序列相同的引物組。 [0035]因此，SEQ ID N0:5所示的序列實際上可以包括一組具有不同標簽序列的引物組， 其中引物的數(shù)量可以是2以上的任何自然數(shù)，具體可以根據(jù)具體應(yīng)用需求確定。一般而言， 十幾條至幾十條帶有標簽序列的序列即可滿足本發(fā)明的應(yīng)用需求。在本發(fā)明的一個實施例 中，SEQ ID N0:5所示的序列實際上包括16條具體的序列，即表2所示的序列。 [0036]表2


[0040]表2中，帶下劃線的序列是標簽序列，長度是10bp。
[0041 ] 在本發(fā)明的引物組中包括SEQ ID N0:6所示的IonPrimer-P和SEQ ID N0:7所示的 IonPrimer-A的情況下，SEQIDN0:6所不的IonPrimer-P和SEQIDN0:7所不的IonPrime;r-A作為嵌套式PCR的外擴增引物，而SEQ ID N0:4所示的IonAdapter-P和SEQ ID N0:5所示的 IonAdapter-A作為嵌套式PCR的內(nèi)擴增引物，進行嵌套式PCR擴增。
[0042]本發(fā)明的試劑盒的特點在于，包括本發(fā)明的引物組。除此之外，還可以包括其它組 分，例如，TN5轉(zhuǎn)座酶，以及任選地用于TN5轉(zhuǎn)座酶的緩沖液；用于PCR擴增的聚合酶，以及任 選地用于上述聚合酶的緩沖液。
[0043] 本發(fā)明還提供一種用于Ion Proton測序平臺的TN5建庫方法，該方法使用SEQ ID NO: 1-3所示的序列與TN5轉(zhuǎn)座酶進行接頭包埋;使用SEQ ID N0:4-5所示的序列對片段化產(chǎn) 物進行PCR擴增。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的方法包括:使用SEQ ID N0:1-3所示的 序列與TN5轉(zhuǎn)座酶進行接頭包埋;使用得到的包埋復(fù)合體對DNA進行片段化處理；使用SEQ ID NO: 4-5所示的序列對片段化產(chǎn)物進行PCR擴增；以及對PCR擴增產(chǎn)物進行純化。
[0044]在進一步改進的方案中，本發(fā)明的方法還包括:在PCR擴增過程中還使用SEQ ID NO :6-7所示的序列。
[0045] 在進一步改進的方案中，其中SEQ ID N0:5所示的序列具體包括:SEQ ID N0:8-23 所示的序列。
[0046]如圖1所示的流程圖，在本發(fā)明的一個具體實施例中，用于Ion Proton測序平臺的 TN5建庫方法包括步驟:TN5轉(zhuǎn)座酶以及接頭設(shè)計和制備;TN5轉(zhuǎn)座酶與接頭(Adapter Mix) 包埋;DNA片段化;片段化反應(yīng)終止;片段化產(chǎn)物PCR擴增;擴增產(chǎn)物純化;