[0025] 圖2是PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)座酶SB100X產(chǎn)物電泳圖。
[0026] 圖3是PCR擴(kuò)增SV40增強(qiáng)子產(chǎn)物電泳圖。
[0027] 圖4是pSV40En-GFP質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖。
[0028] 圖5是pSV40En-VASA-GFP質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖。
[0029] 圖 6是pSV40En-VASA-GFP質(zhì)粒圖譜。
[0030] 圖7是pSV40En-VASA-SB100X質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖。
[0031]圖 8是pSV40En-VASA-SB100X質(zhì)粒圖譜。
[0032]圖9是不同啟動子質(zhì)粒顯微注射雞胚14D后熒光圖。圖中，P:陽性;N:正常對照。
【具體實施方式】
[0033]為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，在本具體實施例中著重以雞類為例，結(jié) 合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。由于雞、鵪鶉、鴿子、火雞、鴕鳥等均為家 禽中的陸禽，其胚胎可在母體外人工孵化，在胚胎早期發(fā)育過程中，PGCs均具有相似的迀移 特性。禽類的vasa基因高度同源，且在PGCs特異表達(dá)。因此本發(fā)明所述的技術(shù)方案適用于包 括雞、鵪鶉、鴿子、火雞、鴕鳥等禽類。
[0034] 實施例1
[0035] 本實施例1是轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒pSV40En-VASA-SB100X的構(gòu)建方法。該轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒包括 PGC特異啟動子(VASA)、SB100X轉(zhuǎn)座酶cDNA序列和Rabbit globin PolyA序列、增強(qiáng)表達(dá)的 SV40增強(qiáng)子（SV40Enhancer)元件。其中，Rabbit globin PolyA序列來自pCAG-GFP載體，長 度為535bp。
[0036] 相關(guān)構(gòu)建方法主要包括以下步驟：
[0037] 1) vasa啟動子元件PCR引物的設(shè)計及其克隆
[0038] 根據(jù)文獻(xiàn)（TAKEO MINEMATSU，TAKASHI HARUMI，AND MITSURU NAIT0，Germ Cell-Specific Expression of GFP Gene Induced by Chicken vasa Homologue(Cvh) Promoter in Early Chicken Embryos.MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 2008,75:1515-1522)所示的vasa基因序列，自行設(shè)計了vasa啟動子元件的PCR擴(kuò)增引物，其 核苷酸序列如下：
[0039] VASA-F:5 '-ATTCTAGAGGCAACCATGACACAAGCAT-3 '；
[0040] VASA-R:5 '-TACCCGGGAGCGAATGCCAGCAGCC-3 '。
[0041] 以雞血液提取的基因組DNA為模板，按上述設(shè)計的擴(kuò)增vasa啟動子元件的引物擴(kuò) 增啟動子片段。反應(yīng)體系總體積為50yL，包括10yL 5x SF Buffer、lyL dNTP、2yL 10μΜ引物 VASA-F、2yL 10μΜ引物VASA-R、lyL Phanta? Super-Fidelity和2yL基因組DNA，加超純水至 SOyl^PCR 擴(kuò)增程序:預(yù)變性 94°C5min;然后 94°C40s，62°C40s，72°C2m30s，共 30 個循環(huán)；最后 TStlOmiruPCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（如圖1)，獲得預(yù)期2198bp大小的產(chǎn)物 片段。將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，與T載體連接，進(jìn)行TA克隆，篩選出陽性克隆測序，測序比 對正確后保存供下一步連接用。
[0042] 2) SB 100X轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)(0RF)的克隆
[0043] 以pCMV-SB100X質(zhì)粒（La jos M&t6s，Marinee K L Chuah，Eyayu Belay，et al ·， Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.Nature Genetics ,2009,41, 753-761)為模板，按所述文獻(xiàn)中列舉的擴(kuò)增SB100X-0RF的引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)座酶基因片段，所述 引物的核苷酸序列分別為:SB100X-0RF F: 5 ' -TACCCGGGGCCACCATGGGAAAATCAAAAGAAAT-3 ' ； SB 100X-0RF R: 5 ' -TTGCGGCCGCCTAGTATTTGGTAGCATTGC-3 '。反應(yīng)體系總體積為50yL，包括 10 yL 5x SF Buffer、lyL dNTP、2yL 10μΜ引物SB100X-0RF F、2yL 10μΜ引物SB100X-0RF R、ly L Phanta? Super-Fidelity和2yL pTNT-SBIOOX模板質(zhì)粒，加超純水至SOyl^PCR擴(kuò)增程序： 預(yù)變性 94°C5min;然后 94°C40s，60°C40s，72°C lm30s，共 30 個循環(huán)；最后 72°C 10min JCR 擴(kuò)增 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖2)，獲得預(yù)期1040bp大小的產(chǎn)物片段。將PCR產(chǎn)物瓊脂 糖凝膠回收，與T載體連接，進(jìn)行TA克隆，篩選出陽性克隆測序，測序比對正確后保存供下一 步連接用。
[0044] 3)SV40Enhancer 元件的克隆
[0045] 以pGL3_control質(zhì)粒(pGL3_control載體為商品化質(zhì)粒，購自Promega公司）為模 板，設(shè)計了擴(kuò)增SV40Enhan Cer的引物擴(kuò)增啟動子片段，所述引物的核苷酸序列分別為：
[0046] SV40En-F:5 '-ATACTAGTTGAACGATGGAGCGGAGA-3 '；
[0047] SV40En-R:5 '-GCTCTAGACGCTGTGGAATGTGTGTCA-3 '。
[0048] 反應(yīng)體系總體積為50yL，包括 10yL 5x SF Buffer、lyL dNTP、2yL 10μΜ引物 SV40En-F、2yL 10μΜ引物SV40En-R、lyL Phanta? Super-Fidelity和3yL pGL3-control，加 超純水至SOyUPCR擴(kuò)增程序：94°〇5111丨11;94°〇4〇8,55°〇4〇8,72°(31111丨11，循環(huán)30次 ；72°〇 lOmiruPCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖3)，獲得預(yù)期大小(約252bp)的產(chǎn)物片 段。將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收，與T載體連接，進(jìn)行TA克隆，篩選出陽性克隆測序，測序比對 正確后保存供下一步連接用。
[0049] 4)pSV40En-GFP 的載體構(gòu)建
[0050]用限制性內(nèi)切酶Spe 1和Xbal將SV40Enhancer從T載體中切出，瓊脂糖凝膠回收。同 時用Spe 1和Xba 1雙酶切pCAG-GFP (pCAG-GFP為商品化質(zhì)粒，購自Addgene公司），切膠回收 3942bp片段作為載體框架。將SV40Ehancer和載體框架連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞ToplO，挑單 菌落至液體培養(yǎng)基LB培養(yǎng)，提質(zhì)粒進(jìn)行電泳及酶切鑒定(如圖4)，分別獲得預(yù)期的3492bp大 小的載體框架和252bp大小的SV40增強(qiáng)子片段，經(jīng)酶切鑒定陽性克隆者命名為 pSV40Enhancer-GFP。
[0051 ] 5)報告基因表達(dá)質(zhì)粒pSV40En-VASA-GFP的載體構(gòu)建
[0052]用限制性內(nèi)切酶Xma 1和Xba 1將vasa啟動子從T載體中切出，瓊脂糖凝膠回收。同時 用Xmal和Xbal雙酶切pSV40Enhancer-GFP，切膠回收4067bp片段作為載體框架。將Vasa啟動 子和載體框架連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞ToplO,挑單菌落至液體培養(yǎng)基LB培養(yǎng)，提質(zhì)粒進(jìn)行 電泳及酶切鑒定，獲得預(yù)期大小的片段4097bp和2198bp(如圖5)，經(jīng)酶切鑒定后陽性克隆者 命名為pSV40Enhancer-VASA-GFP(如圖6)，圖中列出部分酶切位點及相應(yīng)的元件名稱。
[0053] 6)轉(zhuǎn)座酶真核表達(dá)質(zhì)粒pSV40En-VASA-SB100X的構(gòu)建
[0054]用限制性內(nèi)切酶Xmal和Not 1將SB100X從T載體中切出，瓊脂糖凝膠回收。同時用 Xmal和Notl雙酶切pSV40Enhancer-VASA-GFP，切膠回收5516bp片段作為載體框架。將 SB100X