拮抗tlr7/8及tlr9活化的藥物分子及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種拮抗TLR7/8及TLR9活化的藥物分子及用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 銀肩病俗稱牛皮癬，是臨床常見的一種慢性炎癥性皮膚病，青壯年者發(fā)病多，病程 較長，易復(fù)發(fā)，呈進行性皮損與角質(zhì)增厚。臨床表現(xiàn)以紅斑、鱗肩為主，全身均可發(fā)病。
[0003] 雖然早期認識到該病是一種與遺傳、感染等有關(guān)的自身免疫性疾病。但具體致病 機制不清楚，致使目前尚無特效藥，主要采用非特異性藥物治療，以軟化角質(zhì)層的對癥策 略，或輔助使用少量激素的治療方案。副作用較大，且療效不理想。
[0004] 近年來，諸多報道逐步表明，銀肩病的致病機制主要是由于自身免疫發(fā)生紊亂，皮 膚巨噬細胞和T淋巴細胞等免疫細胞上的Toll樣受體(TLRs)家族中的TLR7/8、9,在識別自 身破損細胞及微生物中的核酸片段后，引發(fā)過度炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致自身表皮細胞進一步損傷， 繼而又促使淋巴細胞聚集和表皮角化，由此，反復(fù)循環(huán)使其不斷惡化。
[0005] 最近，國外采用特殊抗體來對抗炎癥因子，如：抗白介素（IL)和腫瘤壞死因子 (TNF)的抗體，取得初步療效。但是，制備工藝較為復(fù)雜，價格昂貴。
[0006] 如何從TLRs活化的源頭來阻斷銀肩病的發(fā)生和發(fā)展，是本領(lǐng)域技術(shù)人員關(guān)注的熱 點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種拮抗TLR7/8及TLR9活化的藥物分子及用途。所述藥物 分子能拮抗TLR7/8及TLR9活化，抑制TNF，IL等促炎因子的釋放，達到抑炎效果;所述藥物分 子與生理鹽水或磷酸緩沖液配制成注射劑，采用皮下注射方式進行治療，可顯著緩解銀肩 病的病理損傷。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0009] 拮抗TLR7/8及TLR9活化的藥物分子，該藥物分子為包含的序列如SEQ ID N0:1所 示的硫代修飾分子結(jié)構(gòu)。
[0010] 該分子的結(jié)構(gòu)為T*G*G*OG*OG*OA*OOOA*OG*G*OOT*G，其中*為硫代修 飾。
[0011] 上述藥物分子在用于制備治療銀肩病藥物中的用途，所述藥物為注射劑，所述注 射劑由上述藥物分子和生理鹽水組成，所述的藥物分子和生理鹽水的重量:體積比為1~2: 3~5〇
[0012] 本發(fā)明所述的注射藥物的制備過程:按上述核苷酸序列，通過普通化學(xué)合成、硫代 修飾并純化的方法獲得，劑型為(水溶性)粉末，可單獨，也可輔以甘露醇膨化劑等混合后， 進行真空包裝，可保存于室溫或4°C冰箱中。
[0013] 使用時，采用普通注射用液體（如：生理鹽水，等)稀釋，通過注射器在患者皮下進 行注射給藥?？砂疵刻煲淮危啥帱c注射，每點10~30^/300μ1，每兩周為一個療程，實際療 程次數(shù)可按臨床具體情況而定。
[0014] 由于本發(fā)明所述注射劑的作用靶點與治療位置明確、效果顯著、安全性好的優(yōu)點， 能顯著抑制促炎因子的釋放，改善銀肩病的病理損傷，可作為治療銀肩病的藥物，具有迫切 的社會健康需求和廣泛的應(yīng)用前景。
[0015] 申請人長期從事Toll樣家族相關(guān)先天免疫研究，深入的研究TLR9阻斷劑C41分子 的作用機制及其適應(yīng)癥，通過實驗驗證，該分子不僅可以阻斷TLR9介導(dǎo)的炎癥活化，同時能 拮抗TLR7/8介導(dǎo)的活化;并且在銀肩病動物模型上，獲得了顯著的療效。而且，c41分子可通 過胞內(nèi)自身代謝，不影響細胞的再次應(yīng)答能力，這使得c41分子既能在疾病活動期起抑制作 用，又不會破壞機體正常免疫。經(jīng)初步安評和藥學(xué)研究，證實該分子穩(wěn)定性好，無毒副作用。 由此，c41分子，即本發(fā)明所述藥物分子，是一種從銀肩病發(fā)病的起始環(huán)節(jié)阻斷炎癥反應(yīng)，從 而到達治療效果的藥物分子，它勢必為廣大銀肩病患者帶來希望，積極推動臨床治療發(fā)展。 [00 16]此外，銀肩病病理損傷主要發(fā)生在表皮、真皮及皮下。通過皮下注射能夠快速使藥 物進入患處，阻止聚集的免疫細胞的活化，藥效更佳。
[0017]本發(fā)明所述重量:體積，當(dāng)重量單位為yg，體積單位則對應(yīng)為μL;當(dāng)重量單位為mg， 體積單位則對應(yīng)為ml;當(dāng)重量單位為Kg，體積單位則對應(yīng)為1。
【附圖說明】
[0018] 圖1為所述藥物抑制巨噬細胞TLR7/8，9活化；
[0019] 圖2為所述藥物改善銀肩病的病理損傷(X20，HE).其中a為安慰劑組，b為c41治療 組。
【具體實施方式】
[0020] 下面的實施例可詳細地說明本發(fā)明，但不以此限制本發(fā)明。
[0021] 實施例1:注射劑制備
[0022] 藥物名稱:c41分子
[0023] 序列結(jié)構(gòu)：TGGCGCGCACCCACGGCCTG [0024] 修飾結(jié)構(gòu)：
[0025] (*為硫代修飾）
[0026]制備方式:化學(xué)合成，委托上海生工公司。產(chǎn)量，采用HPLC純化，抽取真空，采用玻 璃瓶保存于室溫，按330yg/瓶(干粉)包裝。
[0027] 使用配置:取一小瓶，注入生理鹽水600μ1，稀釋混勻，備用。
[0028] 實施例2: c41分子抑制TLR7/8和9的活化鑒定
[0029] 2.1主要材料、試劑與設(shè)備：
[0030] 1)細胞株:RAW264 · 7 (ATCC，USA ·)。
[0031] 2)細胞培養(yǎng)基:DMEM(Gibco，Inc.，USA)。
[0032] 3)Elisa試劑盒：抗鼠 TNF_a(eBioscience，Inc · ,USA) 〇
[0033] 4)細胞培養(yǎng)箱:FORMA 3111.
[0034] 5)酶標(biāo)儀:全波長多功能酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，USA) ·
[0035] 2 · 2實驗方法：將RAW264 · 7細胞稀釋至I X IOfVmL，加入96孔板（200yL/孔），置37 °C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，加入TLR7/8激動劑R848(5yl，終濃度100ng/ml)為實驗一組;加 入TLR9激動劑CpG-0DN18265yl(5yl，終濃度4μΜ)為實驗二組，以上各組均設(shè)8復(fù)孔。然后，各 組分出4復(fù)孔，加培養(yǎng)液5μ1，分別作為安慰劑一組、二組;各組剩余的4復(fù)孔，分別加入本發(fā) 明所述藥物c41分子5μ1(終濃度4μΜ)作為治療一組、二組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集上清，進行 El isa檢測，獲取TNF-a濃度。
[0036] 2.3實驗結(jié)果：安慰劑一組，TLR7/8正?；罨?，刺激RAW264.7細胞釋放大量TNF-a， 安慰劑二組，TLR9正?；罨?，刺激RAW264.7細胞釋放大量TNF-a;治療一組和二組，在本發(fā)明 所述藥物c41分子作用下，RAW264.7細胞釋放TNF-a水平受到顯著抑制(P〈0.01)，所以，該藥 物能有效抑制銀肩病的關(guān)鍵靶標(biāo)，遏制過度炎癥反應(yīng)。如附圖1所示。
[0037]實施例3:皮下注射治療銀肩病及其療效。
[0038] 3.1主要材料、試劑與設(shè)備：
[0039] 1)動物:Balb/c(華阜康生物科技股份有限公司，中國）。
[0040] 2)建模藥物:咪喹莫特（明欣藥業(yè)，中國）。
[0041] 3)治療藥物:本發(fā)明所述注射劑(詳見實施例1)
[0042] 3.2實驗方法：
[0043] 1)小鼠剃毛后，小鼠剃毛后，咪喹莫特背部建立銀肩病模型，20mg/cm2,每天1次， 持續(xù)6天。
[0044] 2)分組:安慰劑組，藥物治療組各5只鼠。
[0045] 3)給藥:安慰劑組:皮下只注射生理鹽水(NS)，100yl/20g體重；治療組:本發(fā)明所 述C41藥物用NS稀釋為550μg/ml皮下注射C41分子100yl/20g體重。
[0046] 4)各組從第一天開始治療，持續(xù)6天。
[0047] 5) 6天后取各組皮膚組織，HE染色，病理觀察。
[0048] 3.3實驗結(jié)果：
[0049]安慰劑組，皮下炎性細胞浸潤，表皮增厚，角質(zhì)化明顯;而治療組，無明顯的炎癥細 胞浸潤，表皮未見角化，說明，本發(fā)明所述注射劑能夠有效遏制銀肩病的病理損傷。如附圖2 所示。
【主權(quán)項】
1. 一種拮抗TLR7/8及TLR9活化的藥物分子，其特征在于：該藥物分子為包含的序列如 SEQ ID NO: 1所示的硫代修飾分子結(jié)構(gòu)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物分子，其特征在于:所述分子的結(jié)構(gòu)為T*G*G*C*G*C*G*C* A*〇C*C*A*C*G*G*C*C*T*G，其中 *為硫代修飾。3. 權(quán)利要求1-2任一所述的藥物分子在用于制備治療銀肩病藥物中的用途。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于:所使用藥物為注射劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于:所述注射劑由權(quán)利要求1或2所述的藥物分 子和生理鹽水或磷酸緩沖液組成。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于:所述的藥物分子和生理鹽水的重量:體積 比為1~2:3~5。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種拮抗TLR7/8及TLR9活化的藥物分子，該藥物分子為包含的序列如SEQ？ID？NO:1所示的硫代修飾分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述藥物分子能拮抗TLR7/8及TLR9活化，抑制TNF，IL等促炎因子的釋放,達到抑炎效果；所述藥物分子與生理鹽水配制成注射劑，采用皮下注射方式進行治療，可顯著緩解銀屑病的病理損傷。
【IPC分類】C07H21/00, A61K31/713, A61P17/06
【公開號】CN105541947
【申請?zhí)枴緾N201610015280
【發(fā)明人】李彥, 劉萬成, 王寧, 楊希川, 劉鑫
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月11日