檢測(cè)e種腸道病毒病原的雙抗體夾心elisa試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛腸道病毒(Bovine enterovirus，BEV)與人脊髓灰質(zhì)炎病毒、人柯薩奇病毒、人 腸道致細(xì)胞病變孤兒病毒，豬腸道病毒等同屬小RNA病毒科腸道病毒屬中的成員，它所引起 的傳染病給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。牛腸道病毒感染臨床上以發(fā)熱、流淚、咳嗽、流鼻 涕、呼吸困難和嚴(yán)重腹瀉為主要特征。本病自上世紀(jì)50年代首次由Moll等報(bào)道以來，其他國 家也相繼報(bào)道有本病發(fā)生。國內(nèi)李英利等于2011年首次從內(nèi)蒙某奶牛場(chǎng)的犢牛糞便樣品中 分離到一株F種腸道病毒，證實(shí)國內(nèi)牛群中存在BEV感染。彭小薇等于2013年從北京地區(qū)某 發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的奶牛也分離出一株F種牛腸道病毒。申請(qǐng)人于2012年從吉林長春地區(qū)爆發(fā) 的一種臨床上以呼吸困難和嚴(yán)重腹瀉，高發(fā)病率和高致死率為主要特征的不明疫病中首次 發(fā)現(xiàn)分離出E種腸道病毒HY12,確定了國內(nèi)牛群存在E種腸道病毒感染。該病在國內(nèi)為新發(fā) 傳染病，嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。有關(guān)BEV感染的診斷方法，尤其是具有特異、敏感、快 速與簡便、適于在基層牛場(chǎng)應(yīng)用的檢測(cè)腸道病毒抗原的方法和試劑盒鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒。
[0004] 一種E種腸道病毒抗原捕獲抗體，它是采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示 的VPl基因，表達(dá)VPl蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的多克隆抗體。
[0005] -種E種腸道病毒酶標(biāo)抗體，是采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 3所示的VP2 基因，表達(dá)VP2蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆抗體。
[0006] 所述的一種E種腸道病毒酶標(biāo)抗體標(biāo)記了辣根過氧化物酶。
[0007] 檢測(cè)E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它的抗原捕獲抗體為上述的一 種E種腸道病毒抗原捕獲抗體，酶標(biāo)抗體為上述的一種E種腸道病毒酶標(biāo)抗體。
[0008] 本發(fā)明提供了檢測(cè)E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它采用其堿基序 列如序列表SEQ ID NO. 1所示的VPl基因，表達(dá)的VPl蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的多克隆 抗體為捕獲抗體，采用其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 3所示的VP2基因，表達(dá)的VP2蛋白， 免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆抗體，并標(biāo)記了辣根過氧化物酶(HRP)。安全性、與RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果具有100%符合率。試劑盒4°C保存6個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)方法無明顯差異。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 1、 具有生物安全性。試劑盒所用的抗E種腸道病毒VPl和VP2的高免抗體為原核載體表 達(dá)的重組蛋白誘導(dǎo)BALB/C小鼠產(chǎn)生，不含E種腸道病毒，因此不存在散毒危險(xiǎn)； 2、 敏感性高。捕獲抗體和HRP標(biāo)記二抗均具有很高的免疫效價(jià)，因此提高了試劑盒的敏 感性和特異性。試劑盒檢測(cè)E種腸道病毒陽性和陰性糞便樣品與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果具有100% 符合率； 3、 特異性強(qiáng)。試劑盒與其他病原體無交叉反應(yīng)，只檢出E種腸道病毒抗原，具有很高特 異性； 4、 穩(wěn)定性好。試劑盒4°C保存6個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)方法無明顯差異，具有很好的穩(wěn)定 性； 5、 快速簡便。試劑盒2.0-2.5 h即可報(bào)告結(jié)果，使用方便，一般技術(shù)人員按說明書即可 操作，條件一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行； 6、 不影響動(dòng)物正常生產(chǎn)。待檢樣品為糞便，采集容易、方便、不影響動(dòng)物正常生產(chǎn)，容易 被基層牛場(chǎng)接受； 7、 價(jià)格便宜。約3元/頭份，HRP標(biāo)記二抗和抗體制備技術(shù)成熟，均可大規(guī)模獲得。
【附圖說明】
[0010]圖I PGEX-4T-1-VP1 和PGEX-4T-1-VP2重組質(zhì)粒酶切鑒定（泳道2、3:pGEX-4T-1-VPl;泳道5、6: PGEX-4T-1-VP2;泳道1、7: PGEX-4T-1 質(zhì)粒陰性對(duì)照；泳道4: DNA分子marker); 圖2重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果(泳道3: pGEX-4T-1-VP 1重組菌未誘導(dǎo)總蛋白；泳道 2:pGEX-4T-1-VPl重組菌誘導(dǎo)后總蛋白；泳道4:pGEX-4T-1-VP2重組菌未誘導(dǎo)總蛋白；泳道 5:pGEX_4T-l_VP2重組菌誘導(dǎo)后總蛋白；泳道1、6:蛋白分子marker); 圖3純化重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果(VP1重組蛋白BSA;VP2重組蛋白BSA); 圖4 E種腸道病毒VPl和VP2抗體免疫熒光鑒定； 圖5試劑盒各組分（（1)包被有VP1捕獲抗體及預(yù)處理的96孔ELISA板；（2)樣品稀釋液； (3)20倍濃縮洗滌液；（4)HRP標(biāo)記抗VP2 IgG; (5)終止液；（6)底物A; (7)底物B; (8)陽性對(duì)照 樣品；（9)陰性對(duì)照樣品）。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1 E種腸道病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl和VP2原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1、 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)目標(biāo)序列的堿基組成，分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增VPl和VP2基因的引物，上下游分別含有 BamHI、EcoR頂每切位點(diǎn)。引物序列如下： 擴(kuò)增VPl序列引物：
2、 基因擴(kuò)增 常規(guī)Trizol法提取E種腸道病毒的基因組RNA，采用市售常規(guī)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明 操作獲得cDNA，并以其為模板分別擴(kuò)增了 VPl基因和VP2基因，PCR反應(yīng)體系：
PCR 運(yùn)行條件：94°C 預(yù)變性 2min;94°C 變性 lmin、54°C 退火 30sec、72°C 延伸 30sec，共 30 個(gè)循環(huán);72°C再延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，取IyL進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0012] 3、目標(biāo)基因與pGEX-4T-l的連接、轉(zhuǎn)化 采用分子生物學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)酶切、連接等技術(shù)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-VP1和 PGEX-4T-1-VP2,并采用CaCl2法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)中。利用含100 yg/mL 氨芐霉素的LB培養(yǎng)平板篩選陽性克隆，并進(jìn)行常規(guī)增菌培養(yǎng)，收獲菌體，提取質(zhì)粒，進(jìn)行 BamHI/EcoRI雙酶切鑒定，如圖1所示。
[0013] 實(shí)施例2 VPl和VP2重組蛋白的表達(dá)及純化 將鑒定的陽性重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-VP1和pGEX-4T-1-VP2轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞 后，挑取單個(gè)菌落接種到3 mL含有100 yg/rnL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后取 I mL上述培養(yǎng)物接種到200 mL含有100 yg/rnL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C振搖培養(yǎng)至 對(duì)數(shù)生長期（OD6QQ=O . 6~0.8)，加入IPTG至終濃度為I mmol/L，20°C誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，獲得了重組目標(biāo)蛋白VPl和VP2,如圖2所示。離心沉淀菌體，超聲破碎后以尿素純 化包涵體方法獲得高純度的重組蛋白，如圖3所示。
[0014]實(shí)施例3抗VPl鼠源多克隆抗體和VP2單克隆抗體的制備與純化 1、 抗VPl鼠源多抗制備:選擇6-8周齡健康BALB/C小鼠，以弗氏完全佐劑乳化純化的VPl 重組蛋白，每只小鼠多點(diǎn)皮下注射共100 yg，之后每間隔14 d按照同樣方法加強(qiáng)免疫一次， 同時(shí)采集血清檢測(cè)效價(jià)。最后一次加強(qiáng)免疫采用直接腹腔注射100 yg純化的蛋白，3~5 d后 采集血液收集血清，即為抗VPl鼠源多抗； 2、 抗VP2單克隆抗體制備：免疫方法同抗VPl鼠源多抗制備，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與 SP2/0混合于融合管內(nèi)，以300 g離心10 min，棄去上清，振蕩細(xì)胞，使兩種細(xì)胞盡量混合均 勻，然后于60 sec內(nèi)緩慢滴加預(yù)熱的PEG-4000溶液，再緩慢加入無血清的1640培養(yǎng)基終止 融合，靜置后再以1 〇〇〇 r/min離心10 min，棄去上清后加入HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞混勻懸浮， 于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第14 d開始換液并開始檢測(cè)篩選分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì) 胞的篩選采用間接ELISA，用純化的VP2蛋白作為包被抗原包被反應(yīng)板，加入雜交瘤細(xì)胞的 培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA篩選;對(duì)ELISA陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)一步克隆至所有孔都為陽性。通過3 次細(xì)胞克隆最終獲得雜交瘤細(xì)胞株4E6。取高壓滅菌的石蠟油0.5 mL，注射到小鼠腹腔，7 d 后腹腔注入IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，一周后抽取腹水，并置37°C 24 h后4°C過夜，然后離心腹水， 取上清，即為抗VP2單抗； 3、 VP2 IgG純化:取單抗腹水5 mL，加入等體積pH7.2，10 mmol/L的PBS緩沖液，混勻后 緩慢加入10 mL飽和硫酸銨，邊加邊攪拌；混合物4°C放置30 min后，以3 OOO rpm離心30 min。沉淀物以10 mL PBS溶解后，緩慢加入5 mL飽和硫酸銨，邊加邊攪拌，混合物4°C放置30 min后，3 000 rpm離心30 min，重復(fù)兩次。最后沉淀溶于4 mL PBS緩沖液中，4°C透析24 h， 蔗糖濃縮后分裝_80°C保存。提取的抗E種腸道病毒VPl和VP2抗體以免疫熒光技術(shù)（IF)進(jìn) 行鑒定，如圖4所示。
[0015] 實(shí)施例4 HRP標(biāo)記抗VP2 IgG制備 應(yīng)用郭春祥法對(duì)純化的IgG進(jìn)行HRP標(biāo)記：將5 mg HRP溶于去離子H2O，并與0.5 mL的 0.1 M NaKk溶液混勻，4°C靜置30 min。然后加入0.5 mL的0.16