一種腫瘤抑制蛋白變體dv204及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，本發(fā)明涉及腫瘤抑制蛋白變體。
【背景技術】
[0002] 腫瘤相關蛋白DENND2D-V2,由468個氨基酸殘基組成，自序列4的氨基末端第47至 145位氨基酸殘基為uDENN結構域，自序列4的氨基末端第146至330位氨基酸殘基為DENN結 構域，自序列4的氨基末端第368至435位氨基酸殘基為dDENN結構域。該腫瘤相關蛋白在小 鼠成纖維細胞內(nèi)穩(wěn)定高表達可以明顯抑制該細胞的惡性轉(zhuǎn)化;在mRNA水平檢測其在細胞系 中的表達結果表明，肺癌細胞系中的表達水平顯著低于原代培養(yǎng)的正常支氣管上皮細胞； 在肺癌臨床組織標本中檢測其表達水平結果表明，肺癌組織的表達水平明顯低于其周邊的 正常組織。該腫瘤相關蛋白可用于腫瘤的體外診斷、預后。含有上述腫瘤相關蛋白編碼基因 的重組真核表達載體在導入肺癌細胞系中后，能單獨引起肺癌細胞系的生長變緩及致瘤性 減弱。因此，該蛋白具有較好的腫瘤藥物應用前景。
[0003] 在現(xiàn)有技術中，為了提高蛋白的活性，針對蛋白的活性位點進行特異性的突變和 取代，從而尋找活性更高的變體是常規(guī)的做法。為了進一步提高該蛋白的生物活性，申請人 通過大量的實驗，針對DENND2D-V2氨基酸序列中特定的位點進行了點突變，從而獲得了比 DENND2D-V2蛋白本身具有更高抑制活性的變體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個對應于SEQ ID NO: 1的成熟多 肽的位置 53Y、60K、70P、79R、92R、97I、109A、131K、141A、204S、225E、232L、253K、270A、271A、 297(：、3056、322￥、3471^、379?、3980、4330或4511^的位置包含修飾。具體而言，本發(fā)明的變體 具有改善的抑制活性。
[0005] 優(yōu)選地，應用于本發(fā)明的方法、呈現(xiàn)改善的抑制活性的蛋白變體包含至少1種任一 下述修飾：53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、 225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、 433Q/S、451L/V。
[0006] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白變體的方法，包括(a)培養(yǎng)宿主細胞;和(b)回收 所述蛋白變體。
[0007] 在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培 養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下 進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料 分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所 述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據(jù) 公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中）。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng) 基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細胞裂解物 (lysate)回收。
[0008] 所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng) 培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。
[0009] 本發(fā)明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析 (例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻）、電泳方法（例如，制備型 (preparative)等電聚焦）、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀）、SDS-PAGE或提取(參見，例如， Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers,New York,1989)〇 [0010]本發(fā)明的多肽用于制備相應的藥物，去用于治療癌癥。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1:DENND2D-v2基因的獲得
[0012] DENND2D-V2：
[0013] 上游引物5 ' CACTCCAGGGGCCATGGATG3 '
[0014] 下游引物5 ' GTCATTCTTATTCACCACAGCTC3 '
[0015] 用上述引物，以人正常肺組織cDNA文庫（Clontech: K1420-1)為模板進行PCR擴增 反應，反應條件如下：
[0016] 反應體積50μ1，其中含有： 人正常肺組織cDNA模板 5 μ l(5ng)
[0017] 引物 正向引物、反向引物終濃度各0.2μ: M dNTP 終濃度各200 μ M Taq DNA 聚合酶 2.5U
[0018] 10 X Taq DNA聚合酶緩沖液 5 μ 1
[0019] 用雙蒸水補足至50μ1體積。
[0020] 反應溫度、時間：94°C，變性5分鐘；然后94°C變性30秒，57°C退火30秒，72°C延伸1 分鐘，擴增30個循環(huán);最后在72°C下延伸10分鐘。
[0021 ]擴增產(chǎn)物為3'帶有堿基A的3'突出粘端片段，用QIAquick膠回收試劑盒(Qiagen， 28706)按產(chǎn)品說明書進行純化，然后與3'有堿基T的線性pGEM-T EASY載體（Promega， A1360)在16°C下連接8小時，使用2mm電極杯，2500V轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化物在含氨芐青 霉素的LB平板培養(yǎng)基上生長，挑選克隆，提取質(zhì)粒，使用AbI PRISM 3700DNA分析儀 (Perkin-Elmer/AppI ied Biosystem)測序，獲得DENND2D_v2基因的全長cDNA，長度為 1905bp，其編碼序列是自序列的5'端第57至1463位脫氧核糖核苷酸，編碼468個氨基酸。
[0022] 實施例2:相應突變后的DENND2D-V2基因的獲得方法
[0023] 1.突變點的引入
[0024] (1)根據(jù)相應的突變位點設計相應的誘變引物，采用PCR定點突變法在DENND2D-V2 基因上把野生型對應的氨基酸位點進行突變；
[0025] (2)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶進行酶切，與經(jīng)過相同酶切的 質(zhì)粒pPIC9k片段連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞；
[0026] 2.鑒定重組質(zhì)粒：用酶切、PCR方法對重組質(zhì)粒進行鑒定，并測序檢驗，由此得到突 變后的核苷酸序列。
[0027] 實施例3、DENND2D_v2變體對肺癌細胞系H1299生長抑制作用
[0028]將實施例2獲得的突變后的核苷酸序列回收后直接正向連入pcDNA3.1/V5-His TOPO TA( Invitrogen，K4800)真核表達載體，經(jīng)雙向測序和酶切鑒定無誤，得到正向插入突 變后的核苷酸序列的cDNA基因質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-DENND2D-V2,簡稱 pcDB3.1-DENND2D-v2〇
[0029] 1、細胞凋亡的觀察與檢測：
[0030] (1)陽性對照質(zhì)粒pcDB3 · I-BAX質(zhì)粒的構建
[00311 pcDB3.1-BAX為凋亡實驗的陽性對照，按照下述方法構建：以人正常肺組織cDNA文 庫（Clontech: K1420-1)為模板，利用Taq酶進行PCR反應擴增BAX的全長cDNA基因 （Genbank No.NM_138761)。瓊脂糖電泳回收PCR產(chǎn)物，連接到pGEM-T-easy載體中進行測序，將測序正 確的片段用限制性內(nèi)切酶EcoRI (Promega)從pGEM-T-Bax載體上切下，同時用EcoRI酶切真 核表達載體pcDNA3 · l/mycHis(-)B(Invitrogen，V85520)，將酶切后的Bax的cDNA基因片段 與載體在16°C下連接8小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化物在含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上 生長，挑選生長的菌落，提取質(zhì)粒，用EcoR頂每切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，挑選有 插入片段的陽性克隆，通過測序（使用ABI PRISM 3700DNA分析儀），選出正確的正向插入 Bax的cDNA基因質(zhì)粒，命名為口0083.1-84乂40083.1-84乂不帶有(：-11^和11丨8標簽。
[0032] (2)瞬時轉(zhuǎn)染H1299細胞:將H1299細胞以IX 105傳入六孔板中，24小時待細胞貼壁 生長后，按照!^口(^6(^3111；[116 2000說明書提供的操作方法，將。00麻3.1/1115^把8(-)13， pcDB3.1-DENND2D-V2變體，pcDB3.1-BAX質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入各孔細胞，所用質(zhì)粒DNA及轉(zhuǎn)染試 劑的量為推薦量的1/2以降低細胞毒性。轉(zhuǎn)染后4小時更換培養(yǎng)基，待轉(zhuǎn)染后36小時收取細 胞。按照Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit(CALBI0CHEM，PF032)說明進行 Annexin V FITC和PI雙染，流式細胞儀檢測。結果如下表所示。
[0033] 2、細胞周期的觀察與檢測：
[0034] ΡΓ流式細胞法進行細胞周期檢測：將空載體H1299-VeCtor細胞，穩(wěn)定高表達 DENND2D-V2變體的H1299-DENND2D-V2變體單克隆細胞以2 X 105個傳入60mm細胞培養(yǎng)皿中， 37°C5 % C02培養(yǎng)至融合率達到80 %左右。消化收取細胞，80 %乙醇（用I3BS配制）-20°C固定 過夜(大于8小時）。經(jīng)PI染色后，上機檢測。如下表所示，DENND2D-V2變體的外源性高表達能 將H1299顯著阻滯在G1/S期。
[0035] 3、軟瓊脂集落形成實驗:采用空載體Hl 299-vector細胞，Hl 299-DENND2D-V2野生 型細胞，篩選得到的穩(wěn)定表達DENND2D-V2變體的H1299-DENND2D-V2變體單克隆細胞株進行 實驗。實驗用六孔板進行，每孔先加入1.5毫升含10%胎牛血清、0.5%瓊脂的DMEM培養(yǎng)基， 室溫冷卻后，將建成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，各5000個細胞加到含10%胎牛血清、0.35%瓊脂糖 的DMEM培養(yǎng)基中，混合后加到上述底層培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-3周，每皿加入0.511110.2%?-iodonitrontetrazilium 〇11；[101^(16染色1小時以上;鏡下觀察照相，計數(shù)大于200微米的克 隆。每組重復三個孔。裸眼及光鏡下觀察，三組平行實驗集落形成結果數(shù)目比較如下表所 不。


[0039]以上實施例說明，DENND2D-V2基因變體可誘導凋亡，在細胞周期G1/S期具有明確 的細胞周期阻滯能力，這是其抑制細胞生長增殖能力的主要原因。同時轉(zhuǎn)入DENND2D-V2變 體后的細胞在軟瓊脂中獨立生長的能力較未突變蛋白明顯減弱。
【主權項】
1. 一種腫瘤抑制蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1所示。2. -種人腫瘤抑制蛋白變體，其特征在于，在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸的基礎上，在 204S/T進行相應的取代。3. 如權利要求2所述的蛋白變體在制備抑制肺癌藥物中的用途。4. 一種抗腫瘤藥物制劑，它含有權利要求2所述的蛋白變體以及藥學上合適的載體。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種腫瘤抑制蛋白的變體。該蛋白變體相對于野生型具有更強的抑制腫瘤細胞生長的效果。這些變體蛋白質(zhì)和它們的衍生物可以用于多種腫瘤的治療。
【IPC分類】A61K38/17, A61P35/00, C07K14/47
【公開號】CN105541993
【申請?zhí)枴緾N201610004101
【發(fā)明人】馬恒標
【申請人】馬恒標
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2014年5月15日
【公告號】CN103992399A, CN103992399B, CN105384806A, CN105418743A, CN105418744A, CN105418745A, CN105418746A, CN105418747A, CN105418748A, CN105418749A, CN105440121A, CN105440122A, CN105461795A, CN105461796A, CN105461797A, CN105461798A, CN105481968A, CN105481969A, CN105481970A, CN105481971A, CN105504040A, CN105504041A, CN105566488A