免疫細(xì)胞的儲存及運(yùn)輸方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種免疫細(xì)胞的儲存及運(yùn)輸方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫細(xì)胞不僅在治療癌癥方面有較好的前景，而且從健康養(yǎng)生的角度來看，也可以在患者本人健康時提取從其外周血中提取免疫細(xì)胞，并在以后患者本人出現(xiàn)免疫低下或其他癥狀時，可以將存儲的免疫細(xì)胞回輸給患者本人，提高患者的免疫力。免疫細(xì)胞的研究和臨床應(yīng)用是一個多學(xué)科、多單位、多部門共同協(xié)調(diào)完成的一項(xiàng)重大復(fù)雜工作，需要有獨(dú)立的細(xì)胞制備單位提供細(xì)胞，獨(dú)立的細(xì)胞移植單位進(jìn)行細(xì)胞移植，并且細(xì)胞制備單位和細(xì)胞移植單位之間有一定的空間距離，要使細(xì)胞制備單位和細(xì)胞移植單位在工作中充分銜接，使細(xì)胞移植達(dá)到最佳的效能，就要有能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范的細(xì)胞儲存運(yùn)輸流程，需要儲存運(yùn)輸?shù)脑济庖呒?xì)胞在儲存、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞等方面都有著非常嚴(yán)格的要求，目前在免疫細(xì)胞的儲存運(yùn)輸方面還沒有形成統(tǒng)一的規(guī)范流程。從而使免疫細(xì)胞在分離、凍存、復(fù)蘇、運(yùn)輸過程中，會對單個細(xì)胞產(chǎn)生損傷，甚至毒性，尤其是凍存過程中會顯著改變細(xì)胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，同時伴隨生物性損傷的危險;而分離細(xì)胞的分離率、純度等對免疫細(xì)胞的應(yīng)用也有極大的影響。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，常規(guī)的Ficoll400分離液對細(xì)胞具有一定的毒性，不利于臨床應(yīng)用，而細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率通常在70%-90%之間。細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率可能會受到細(xì)胞采集、分離、凍存等過程的影響。因此，為提供足夠量的淋巴細(xì)胞，現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率仍需進(jìn)一步提高，同時也應(yīng)避免回輸給患者時出現(xiàn)惡心、嘔吐或過敏等不良反應(yīng)，提尚安全性。
[0004]因此，有必要提供一種能夠有效提高免疫細(xì)胞分離率和細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率、減少運(yùn)輸過程中的損傷和提高回輸?shù)交颊叩募?xì)胞的安全性的儲存及運(yùn)輸方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠有效提高免疫細(xì)胞分離率和細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的存活率、減少運(yùn)輸過程中的損傷和提高回輸?shù)交颊叩募?xì)胞的免疫細(xì)胞的安全性的免疫細(xì)胞的儲存及運(yùn)輸方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供技術(shù)方案如下:
[0007]—方面，提供一種免疫細(xì)胞的儲存及運(yùn)輸方法，包括如下步驟:
[0008]I)采集外周血或臍帶血，加入等體積的生理鹽水或無血清培養(yǎng)基稀釋，獲得細(xì)胞懸液；
[0009]2)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和氨基酸的分離液加入到離心管中，所述細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液平鋪到分離液上，在8-25°(3，20(^-80(^，10?301^11條件下離心，吸取上層血漿備用，吸取白膜層細(xì)胞獲得淋巴細(xì)胞；
[0010]3)將所述淋巴細(xì)胞與含有12 %DMS0+18 %所述上層血漿+5 %海藻糖+5 %甘油+60%注射用生理鹽水的凍存液等比例混合分裝于細(xì)胞凍存管中；將所述凍存管管口密封置于裝有異丙醇的凍存盒中；先于_80°C冷凍，然后轉(zhuǎn)入液氮中凍存；
[0011]4)將恒溫水浴箱溫度調(diào)節(jié)至37°C?39°C，從液氮中取出凍存管立即投入恒溫水浴箱中輕輕晃動，直至凍存管中的固態(tài)變?yōu)橐后w狀態(tài);將此液態(tài)細(xì)胞懸液移至含有4?8°C生理鹽水的離心管中，混勻，細(xì)胞懸液的濃度為I?6\106細(xì)胞/1111，4-8°(3，50(^-80(^，10?30min條件下離心收集淋巴細(xì)胞；
[0012]5)在淋巴細(xì)胞中加入含有2%海藻糖的保存液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為I?6 X 16細(xì)胞/ml;檢查淋巴細(xì)胞存活率及細(xì)菌、內(nèi)毒素、支原體;進(jìn)行免疫學(xué)檢查;移入無菌管或轉(zhuǎn)運(yùn)袋中，使用2?8°C恒溫保溫箱在時間小于等于24小時內(nèi)運(yùn)輸至使用單位。
[0013]本發(fā)明從分離到凍存再到保存運(yùn)輸均選用符合靜注級原料藥標(biāo)準(zhǔn)的原料，原料不確定性小，安全性高;本發(fā)明的分離液采用的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品；海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個葡萄糖分子以I，1_糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對單個核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細(xì)胞的沉淀;L-甲硫氨酸、L-纈氨酸、L-纈氨酸在保持淋巴細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上對提高分離淋巴細(xì)胞分離率也具有一定的幫助;本發(fā)明的分離液對血液樣品進(jìn)行離心處理后，淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞將在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶，而紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其他細(xì)胞在離心力及本發(fā)明組合物的作用下分布在離心管底和分離介質(zhì)層；本發(fā)明使用自體血漿作為凍存液的一部分，右旋糖酐作為替代血漿，減少免疫反應(yīng)，使用DMS0、海藻糖降低低溫對細(xì)胞的傷害，而且分離液的組分與凍存液組分部分接近，進(jìn)一步減少外源物質(zhì)對細(xì)胞的傷害，提高安全性;本發(fā)明在保存液中加入2%的海藻糖進(jìn)一步保護(hù)細(xì)胞，使細(xì)胞在運(yùn)輸過程中保持活性。
[0014]進(jìn)一步地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐I?4重量份，海藻糖4?6重量份，超低粘度海藻酸鈉0.3?1.5重量份，泛影葡胺4?7重量份，L-甲硫氨酸
0.003-0.006重量份，L-纈氨酸0.008-0.011重量份和L-亮氨酸0.01-0.012重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0015]本發(fā)明的分離液采用的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品；海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個葡萄糖分子以I，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對單個核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用；超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細(xì)胞的沉淀;L-甲硫氨酸、L-纈氨酸、L-纈氨酸在保持淋巴細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上對提高分離淋巴細(xì)胞分離率也具有一定的幫助;本發(fā)明的分離液中的各組分配比合理從而起到良好的分離效果O
[0016]進(jìn)一步地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐1.5?3.5重量份，海藻糖4.5?5.5重量份，超低粘度海藻酸鈉0.3?I重量份，泛影葡胺4?6重量份，L-甲硫氛酸0.004-0.005重量份，L-繳氛酸0.009-0.01重量份和L-殼氛酸0.01-0.012重量份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0017]優(yōu)選地，所述分離液的制備方法為:將符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的右旋糖酐2.5重量份，海藻糖5重量份，超低粘度海藻酸鈉0.6重量份，泛影葡胺4.5重量份，L-甲硫氨酸0.005重量份，L-纈氨酸0.01重量份和L-亮氨酸0.011份充分溶解于滅菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再經(jīng)過0.22μπι濾膜過濾制得分離液。
[0018]進(jìn)一步地，所述右旋糖酐為Dextran70。
[0019]進(jìn)一步地，所述分離液的密度為1.070?1.09(^/0113，滲透壓為275?300811101/1^，pH為6?9，粘度為3.0?5.0cp。
[0020]綜上所述，本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為:
[0021]本發(fā)明從分離到凍存再到保存運(yùn)輸均選用符合靜注級原料藥標(biāo)準(zhǔn)的原料，原料不確定性小，安全性高;本發(fā)明的分離液采用的右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。臨床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血漿代用品；海藻糖又稱漏蘆糖、蕈糖等，是一種安全、可靠的天然糖類；由兩個葡萄糖分子以I，1_糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，對多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用，對單個核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用;超低粘度海藻酸鈉具有較低的粘度，較多的羥基有助于紅細(xì)胞的沉淀;L-甲硫氨酸、L-纈氨酸、L-纈氨酸在保持淋巴細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上對提高分離淋巴細(xì)胞分離率也具有一定的幫助;本發(fā)明的分離液中的各組分配比合理從而起到良好的分離效果;本發(fā)明的分離液對血液樣品進(jìn)行離心處理后，淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞將在分離介質(zhì)和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細(xì)胞條帶，而紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等其他細(xì)胞在離心力及本發(fā)明組合物的作用下分布在離心管底和分離介質(zhì)層;本發(fā)明使用自體血漿作為凍存液的一部分，右旋糖酐作為替代血漿，減少免疫反應(yīng)，使用DMS0、海藻糖降低低溫對細(xì)胞的傷害，而且分離液的組分與凍存液組分部分接近，進(jìn)一步減少外源物質(zhì)對細(xì)胞的傷害，提高安全性;本發(fā)明在保存液中加入2 %的海藻糖進(jìn)一步保護(hù)細(xì)胞，使細(xì)胞在運(yùn)輸過程中保持活性。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為使本發(fā)明的實(shí)施例要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。但本發(fā)明絕非限于這些例子。以下所述僅為本發(fā)明較好的實(shí)施例，僅僅用以解釋本發(fā)明，并不能因此而理解為本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
[0023]實(shí)施例一
[0024]免疫細(xì)胞的儲存及運(yùn)輸方法，包括如下步驟:
[0025]I)采集外周血或臍帶血，加入等體積的生理鹽水或無血清培養(yǎng)基稀釋，獲得細(xì)胞懸液；
[0026]2)將含有海藻糖，超低粘度海藻酸鈉和氨基酸的分離液加入到離心管中，所述細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液平鋪到分離液上，在8-25°(3，20(^-80(^，10?301^11條件下離心，吸取上層血漿備用，吸取白膜層細(xì)胞獲得淋巴細(xì)胞；
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