蝴蝶蘭成花相關(guān)GIGANTEA基因（DhGI1）的編碼序列及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體是設(shè)及一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的成花相關(guān) GIGANTEA基因 （DhGI 1)的克隆，該基因序列的分析，基因表達(dá)模式的分析，目的基因表達(dá)載 體的構(gòu)建，植物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株的獲得W及相應(yīng)的生理特性的鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 蝴蝶蘭作為一種具有較好經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值的花弁深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛， 但其成花需要電力降溫或高山催花，運(yùn)就大大提高了其生產(chǎn)成本。因此，很多學(xué)者就嘗試通 過基因工程手段調(diào)控蝴蝶蘭花期，W降低生產(chǎn)成本。韓穎穎等(2004、2005)在蝴蝶蘭花瓣中 得到了查爾酬合酶cDNA(pchs)，并成功轉(zhuǎn)化煙草證明其參與花的形態(tài)建成。Zhang等(2010) 在曲alaenopsiS hyb;rida(CV. wedding promenade)中成功分離得到FTORICAULA/LEAFT (化0/LFY)的同源基因化alLFY，通過半定量RT-PCR得出化alLFY是蝴蝶蘭成花的關(guān)鍵基因。 轉(zhuǎn)基因方面的研究也取得了一定的進(jìn)展，Belarmino等(2000)首先成功報(bào)道了用農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的方法開展蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因；Mishiba等（2005)用未成熟的圓球莖與農(nóng)桿菌(包含gus和潮 霉素抗性基因）共培養(yǎng)，在篩選培養(yǎng)基上(含20mg/L的潮霉素)PLB再生獲得蝴蝶蘭抗潮霉素 的抗性植株;Qin等(2010)用葉片誘導(dǎo)出的愈傷組織與含有抗冷基因 LTP的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)， 得到了大量的抗冷蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因植株。但是，有關(guān)蝴蝶蘭GIGANTEA基因 (DhGI 1)的研究還尚 未見報(bào)道。
[0003] 目前GI基因及同源基因功能分析主要集中在如擬南芥、金魚草等長(zhǎng)日照植物和水 稻、菊花等短日照植物上，研究表明GI基因在不同物種中的功能差異很大，有時(shí)甚至相反， 如在擬南芥GI基因的表達(dá)是促進(jìn)開花，而在水稻則抑制開花。目前GI基因在光期純感植物 的生物學(xué)功能研究尚未見報(bào)道，對(duì)開花具體調(diào)控機(jī)理尚不清楚。
[0004] 本發(fā)明研究了一種從蝴蝶蘭中克隆出來的與成花相關(guān)GIGANTEA基因（DhGIl)，轉(zhuǎn) 入擬南芥后引起花期提早。而在本發(fā)明公布之前尚未見公開報(bào)道過蝴蝶蘭成花相關(guān) GIGANTEA基因（DhGIl)的核巧酸序列及其在轉(zhuǎn)基因植株中應(yīng)用的資料。本申請(qǐng)?zhí)矫髁薌I基 因在光期純感植物的生物學(xué)功能，通過對(duì)比試驗(yàn)摸索了一套光周期頓感植物誘導(dǎo)其成花方 法。同時(shí)，理論上還掲示了蝴蝶蘭成花"溫敏"現(xiàn)象的分子機(jī)理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種從蝴蝶蘭中克隆出來的與成花相關(guān)的 GIGANTEA基因，W及利用該基因在調(diào)控植物花期上的應(yīng)用。
[0006] 解決上述技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本蝴蝶蘭成花相關(guān)GIGANTEA基因化hGI 1)為具有特定序列的DNA分子，編碼區(qū)全長(zhǎng) 402化P，包含一個(gè)3483 bp的開放閱讀框，具有SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[000引本蝴蝶蘭成花相關(guān)GIGANTEA基因（DhGIl)編碼的蛋白質(zhì)分子，具有SEQ ID NO.2所 示的氨基酸編碼序列。
[0009]本蝴蝶蘭成花相關(guān)GIGANTEA基因（DhGIl)的核巧酸引物序列，保守區(qū)設(shè)計(jì)的一系 列的RACE引物和RT-PCR引物序列見表1和表2。
[0010] 表1.通用引物
[0011]
[0012]
[0013]
[0014] 本蝴蝶蘭成花相關(guān)GIGANTEA基因（DhGIl)的核巧酸編碼序列SEQ ID N0.1轉(zhuǎn)入擬 南芥W改變開花時(shí)間的方法按如下步驟進(jìn)行：
[0015] (1)將蝴蝶蘭GIGANTEA基因(DhGIl)的開放閱讀框連接入植物表達(dá)載體，形成含有 蝴蝶蘭DhGIl基因的植物表達(dá)載體；
[0016] (2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，用含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液浸泡擬南 芥花序，收集轉(zhuǎn)基因種子；
[0017] (3)通過對(duì)擬南芥種子抗生素篩選和PCR鑒定，獲得再生轉(zhuǎn)基因植株，開花時(shí)間比 野生型擬南芥提早。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)樣品中是否存在蝴蝶蘭化GI1基因的核巧酸序列 SEQ ID N0.1的方法，使用SEQ ID ^).4的核巧酸序列（見表3)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥0魁進(jìn)行口〇? 擴(kuò)增，然后電泳檢測(cè)目的片段的有無。
[0019] 表3.驗(yàn)證用引物序列
[0020]
[0021]本發(fā)明的有益效果是:觀察和記錄篩選到的轉(zhuǎn)基因化GI1純合子植株表型特征，發(fā) 現(xiàn)化GI1轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥提前5-6天開花，DhGIl轉(zhuǎn)基因擬南芥開花所需時(shí)間 為30天，而野生型擬南芥開花所需時(shí)間為35天。DhGIl轉(zhuǎn)基因擬南芥蓮座葉的數(shù)量較野生型 少，DhGIl轉(zhuǎn)基因擬南芥蓮座葉數(shù)為10張，而野生型擬南芥蓮座葉數(shù)為13張。由此推測(cè)， DhGIl基因參與了擬南芥的成花過程，可推斷化GI1基因參與了蝴蝶蘭的成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同 時(shí)也可推測(cè)通過人為地過量表達(dá)或抑制表達(dá)化GIl基因，可調(diào)控蝴蝶蘭花期，能夠降低其生 產(chǎn)成本，達(dá)到周年生產(chǎn)蝴蝶蘭產(chǎn)品目的。另外，可通過GI基因的調(diào)控方法，可調(diào)節(jié)其它光期 純感觀賞園藝植物花期，提高產(chǎn)品品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。本申請(qǐng)?zhí)钛a(bǔ)了 GI基因在光期純感植物 的生物學(xué)功能研究的空白，豐富了光周期誘導(dǎo)植物的成花理論和方法。同時(shí)，在理論上還掲 示了蝴蝶蘭成花"溫敏"現(xiàn)象分子機(jī)理。
【附圖說明】
[0022] 圖1為經(jīng)低溫處理40天的蝴蝶蘭葉片組織提取的總RNA電泳圖。
[0023] 圖2為3'RACE擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。
[0024] 圖3為5'RACE擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。
[0025] 圖4為DhGIl基因核巧酸序列及所編碼的蛋白質(zhì)序列。
[00%]圖5為DhGIl基因在蝴蝶蘭不同生長(zhǎng)階段各組織表達(dá)模式圖。
[0027] 圖6上為DhGIl基因在低溫處理過程中根組織表達(dá)情況圖。
[0028] 圖6中為DhGIl基因在低溫處理過程中莖組織表達(dá)情況圖。
[00巧]圖6下為DhGIl基因在低溫處理過程中葉組織表達(dá)情況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面將與本申請(qǐng)相關(guān)的試驗(yàn)情況作一介紹。下列實(shí)例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件，如Sambrook.J.等主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述條件，或按照 制造廠商所建議的條件。
[0031] 試驗(yàn)一
[0032] 一、蝴蝶蘭DhGIl基因的克隆
[0033] 1. W蝴蝶蘭Doritaenopsis'Tinny Tender'為試驗(yàn)材料，植物材料在光照培養(yǎng)箱 內(nèi)正常生長(zhǎng)，光照培養(yǎng)箱光周期為16h/化（明期/黑暗），光照強(qiáng)度為150±10皿〇1 . πΓ2 · S 一1，光照條件下溫度為22°C，黑暗條件下溫度為18°C。
[0034] 2.總 RNA 提取
[0035] (1)取約lOOmg凍好的蝴蝶蘭葉片，液氮研磨充分，將粉末移入到1.5ml離屯、管中；
[0036] (2) W樣品體積不超過化izol試劑體積的10%的量，迅速加入lmlT;rizol試劑，并 迅速混勻，室溫條件下凈置5min;
[0037] (3)加300μ1的氯仿及加或不加50ιι1β-疏基乙醇，用手劇烈搖蕩15秒，室溫條件下 靜置5 ±1分鐘；
[0038] (4)4°C，12000巧 m 離屯、15 分鐘；
[0039] (5)將離屯、分離的上清液500ml轉(zhuǎn)入一新離屯、管，加0.5ml異丙醇和3 Μ化0AC， 抑5.2，室溫條件下沉淀10分鐘；
[0040] (6)4°C，12000巧 m 離屯、15 分鐘；
[0041 ] (7)棄上清液，加1ml濃度為75 %的乙醇清洗RNA，振蕩片刻后，750化pm離屯、5分鐘， 細(xì)屯、棄上清液；
[0042] (8)室溫靜置30min，使RNA沉淀干燥到視力察覺不到水分，加入50μ1 DEPC水溶解， 采用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，并取化1進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量；
[0043] (9)將樣品保存于-70°C超低溫冰箱中備用。
[0044] 3.DNA 消化
[0045] 用面aseI (購(gòu)自TaKaRa公司）去除總RNA中的基因組DNA，方法參照試劑說明書進(jìn) 行。
[0046] 4.反轉(zhuǎn)錄
[0047] 采用匪LV反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自Clontech公司）逆轉(zhuǎn)錄mRNA成cDNA第一鏈，方法按照實(shí)際 說明書進(jìn)行。
[004引 5.基因克隆
[0049] (1)3'RACE 擴(kuò)增 DhGIl 的 3'端
[0050] 根據(jù)建立的cDNA文庫(kù)中的已知片段設(shè)計(jì)上游特異性引物，WAP為引物反轉(zhuǎn)錄出的 cDNA為模板，依次使用3GSP1/AUAP和3GSP2/AUAP進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增出的目的 片段割膠回收，連接轉(zhuǎn)化，克隆，測(cè)序。具體引物序列見SEQ ID NO.3。
[0化1] (2) 5'RACE 擴(kuò)增 DhGIl 的5'端
[0052]根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄特異性引物和下游引物，使用5GSP1/AAP進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增，使用5GSP2/AUAP進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增出的目的片段割膠回收，連接轉(zhuǎn)化，克 隆，測(cè)序。具體引物序列見SEQ ID NO. 3。
[00對(duì) （3)序列拼接
[0054]根據(jù)得到的3'序列和5'序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，得到基因的序列全長(zhǎng)。 [005引試驗(yàn)二
[0化6] 二、RT-PCR檢測(cè)蝴蝶蘭DhGIl基因的表達(dá)模式
[0057]根據(jù)所得到的蝴蝶蘭化GI1的序列，用Prime巧軟件設(shè)計(jì)蝴蝶蘭化GI1基因的特異 性引物序列見表3。
[0化引 1.總RNA提取
[0059] 具體步驟同試驗(yàn)一之2。
[0060] 2.反轉(zhuǎn)錄<