提高馬鈴薯莖塊抗氧化能力的基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及基因工程技術領域，特別是設及提高馬鈴馨莖塊抗氧化能力的基因及 其應用，可W賦予植物更多的積累四種單咖啡酷奎尼酸等，W及二種黃酬醇類Ξ糖等物質， 并提高馬鈴馨抗氧化能力。
【背景技術】
[0002] 單咖啡酷奎尼酸，是由咖啡酸(Caffeic acid)與奎尼酸(Quinic acicUl-徑基六 氨沒食子酸)生成的縮酪酸，是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素 類化合物主要存在于茄科植物，W及咖啡，蘋果，及梨中。近20年來，國內外學者就單咖啡酷 奎尼酸的植物化學和藥理學進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)運類化合物具有一些重要的生物活性， 極具臨床價值。根據(jù)咖啡酷在奎尼酸上的位置不同，從理論上講，可分為1-咖啡酷奎尼酸， 3-咖啡酷奎尼酸，4-咖啡酷奎尼酸和5-咖啡酷奎尼酸(綠原酸）。在人體中，單咖啡酷奎尼酸 主要直接被小腸吸收(Williamson et al.，2000)，并具有清除其中過氧自由基的能力 (Nardini et al., 2002)〇
[0003] 1-咖啡酷奎尼酸在NF-κΒ途徑中作為潛在抑制子具有抗癌能力，不僅在免疫反應 的初期起作用，同樣可W在免疫進程的各個階段產(chǎn)生影響(Aggarwal et al.，2006;化an et al.，2013)。3-咖啡酷奎尼酸作為人類飲食中最豐富的多酪類物質，具有預防肝臟疾 病，高血脂W及肥胖的生物學功能（Sakulnarmrat et al., 2012; Hu et al., 2015)。4- 咖啡酷奎尼酸是中藥玫瑰茄中消炎的重要成分物質（Zhen et al.，2016)。5-咖啡酷奎尼 酸俗稱綠原酸，主要生物活性包括(1)對透明質酸酶及葡萄糖-6-憐酸酶的抑制作用；（2)對 自由基的清除及抗脂質過氧化作用；（3)抗誘變作用；（4)保肝利膽作用；巧)抗菌、抗病毒及 解疫等作用。
[0004] 目前主要通過常規(guī)手段利用天然材料(銀杏葉、洋蔥、巧樣、各種中藥材等)為基礎 的化學方法獲得，受到原材料來源不足、含量偏低、初提物成份復雜及相關藥理毒性不清等 因素的嚴重限制，由少數(shù)公司控制下游產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售，價格居高不下。
[000引目前廣泛種植的馬鈴馨僅含有少量的黃酬醇(其中黃酬醇類Ξ糖近乎痕量)和單 咖啡酷奎尼酸。利用馬鈴馨作為生物反應器生產(chǎn)植物疫苗、化合物等正成為基因工程研究 的一個熱點。馬鈴馨是重要的轉基因受體植物，農桿菌介導的馬鈴馨莖段轉化法從報道之 后一直得到廣泛應用。但是如何能夠提高馬鈴馨體內多種單咖啡酷奎尼酸及搬皮素-葡萄 糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧及山糞酪-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧兩種黃酬醇類Ξ糖的含量， 進而提高馬鈴馨莖塊抗氧化能力一直是現(xiàn)有常規(guī)技術無法解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的就是針對上述存在的問題而提供一種提高馬鈴馨莖塊抗氧化能力 的基因及其應用。本發(fā)明提供了一種W增加馬鈴馨莖塊中積累單咖啡酷奎尼酸包括1-咖啡 酷奎尼酸(提高3.51倍）、3-咖啡酷奎尼酸(提高5.45倍）、4-咖啡酷奎尼酸(提高5.37倍）、5- 咖啡酷奎尼酸(綠原酸）(提高3.72倍)等，W及通過對葡萄糖基轉移酶基因的調控提高搬皮 素-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧(提高13.50倍)及山糞酪-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧(提 高4.46倍)等黃酬醇類Ξ糖物質含量，并提高馬鈴馨莖塊抗氧化能力（2倍W上）的cDNA片 段CQAIP1，其基因序列如SEQ ID NO:l所示，該片段從擬南芥中獲得，本發(fā)明利用馬鈴馨自 身莖塊特異性表達啟動子化tatin-2,驅動外源基因 CQAIP1在馬鈴馨莖塊中特異表達，大大 提高了馬鈴馨莖塊中4種單咖啡酷奎尼酸及巧巾黃酬醇類Ξ糖類物質含量，從根本上大幅度 提高馬鈴馨莖塊的抗氧化能力。
[0007] 本發(fā)明W栽培型馬鈴馨作為生物反應器生產(chǎn)多種單咖啡酷奎尼酸及高含黃酬醇 類Ξ糖生物制品，實行產(chǎn)業(yè)化;也可W此獲得馬鈴馨的工程細胞，通過細胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)四 種單咖啡酷奎尼酸及兩種黃酬醇類Ξ糖。同時本發(fā)明中馬鈴馨用的轉化載體可W通過雌二 醇的誘導作用剔除篩選標記，得到具有食用安全性的馬鈴馨品種，進行品種培育。
[0008] 本發(fā)明的提高馬鈴馨莖塊抗氧化能力的基因及其應用技術方案為，本發(fā)明首先提 供了提高馬鈴馨莖塊抗氧化能力的基因 CQAIP1，其核酸序列如SEQ ID N0:1所示：

[0009] 本發(fā)明是通過特異引物CQAIPl Fl，其基因序列如SEQ ID N0:2所示:acttttgtgg tcagtggaat a,和CQAIPl Rl，其基因序列如SEQ ID N0:3所示：aacggatcaa tcaatatcat，采 用現(xiàn)有技術高保真擴增全長SEQ ID NO: 1基因，獲得基因序列如SEQ ID NO: 1所示的基因片 段。
[0010] 之后通過特異引物化tatin-2 F1，其基因序列如SEQ ID N0:4所示：atgactagtg ttcagtaatt gaccggagac，和化tatin-2 Rl，其基因序列如SEQ ID N0:5所示：atggaattca attttgttgg tgctttgag，W馬鈴馨品種中蔬4號基因組DNA為模版，組合擴增出編碼 ?曰1曰1111-2啟動子的0臟序列，其基因序列如569 10^:6所示：

[0011]在獲得上述兩段基因片段之后，采用趾ol-Spel雙酶切后去掉GFP片段并用上述兩 段基因片段替換掉常用植物表達載體PX6-GFP中的GFP基因，最終即可獲得植物表達載體 pX6-Patatin-2::CQAIPl〇
[0012] 獲得的植物表達載體pX6-Patatin-2: :CQAIP1，導入農桿菌工程菌株AGLl。通過莖 段法轉化馬鈴馨品種Desiree，獲得PCR轉基因植株，通過特異引物CQAIP1 F1，其基因序列 如SEQ ID N0:2所示，和CQAIP1 R1，其基因序列如SEQ ID N0:3所示，擴增轉入載體的 CQAIP1整體序列，驗證轉基因陽性植株。利用HPLC對轉基因陽性株系的馬鈴馨莖塊進行全 部單咖啡酷奎尼酸與兩種黃酬醇類Ξ糖含量檢測，轉基因材料的莖塊中上述物質的含量都 有明顯的提高，通過ABTS+方法測量馬鈴馨莖塊的抗氧化能力相比野生型有明顯的提高。采 用qRT-PCR(Real time如anti化tive PCR)技術，通過葡萄糖基轉移酶基因引物GF1，其基 因序列如沈Q ID N0:7所示：ggatggaact cgattctgga，和GR1，其基因序列如沈Q ID N0:8 所示：Caccttcaat ttgcagacca，對葡萄糖基轉移酶基因進行表達量分析，其基因序列如 沈Q ID NO:9所示：

證實提高搬皮素-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧及山糞酪-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧 兩種黃酬醇類Ξ糖含量，主要原因在于葡萄糖基轉移酶基因表達量的大幅度提高。
[001引在上述技術的基礎上，根據(jù)已經(jīng)克隆的CQAIP1基因作探針，從cDNA和基因組文庫 中篩選可得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技 術，也可W從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的CQAIPl基因 W及任何感興趣的一段 DNA或與其同源的一段DNA。采用W上技術，可W分離得到包含CQAIP1基因的序列包括基因 片段的基本上相當于SEQ ID NO: 1所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO: 1所示序 列的亞片段，將運一序列與合適的載體連接，可W轉入植物細胞，產(chǎn)生轉基因植物。
[0014]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明首次提供了一種通過賦予茄科植物積累四種單咖啡 酷奎尼酸包括1-咖啡酷奎尼酸、3-咖啡酷奎尼酸、4-咖啡酷奎尼酸、5-咖啡酷奎尼酸(綠原 酸）；及黃酬醇類Ξ糖包括搬皮素-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧及山糞酪-葡萄糖-葡萄糖 巧-鼠李糖巧等，進而大幅度提高茄科植物抗氧化能力的cDNA片段，該片段對上述兩種黃酬 醇類Ξ糖物