利用黃萎病菌VdP4-ATPase基因提高植物對黃萎病抗性的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領域。具體地說，設及利用基因工程技術提高植物抗病 性的方法。 技術背景
[0002] 黃萎病嚴重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，全球每年因黃萎病引起的損失達數(shù)十億美元 (Pegg et al. ,2002)。報道稱馬鈴馨因感染黃萎病年產(chǎn)量減少50% W上，通常情況下可W 引起 10-15%的減產(chǎn)(Powelson et al.，1993;Rowe et al.，1987,2002);生菜種植區(qū)，黃萎 病引起的損失非常容易達到100% (Subbarao et al. , 1997) ;Levinet(2003)等研究發(fā)現(xiàn)， 油橄攬因黃萎病引起的減產(chǎn)可W達到70% W上；黃萎病也是多數(shù)植棉國家的棉花主要病 害，比如，澳大利亞、己西、保加利亞、中國、希臘、秘魯、±耳其、烏干達、美國和烏茲別克斯 坦等國家，可W造成30%W上棉花的減產(chǎn)(Bolek et曰1.，2005)，發(fā)病嚴重的地區(qū)或年份減 產(chǎn)可W達到100%。黃萎病是制約我國棉花生產(chǎn)的一種主要病害，目前我國各棉區(qū)的發(fā)病面 積已占植棉總面積的50% W上，每年損失皮棉7.5-10萬噸，直接經(jīng)濟損失16-20億元（肖松 華等，2006)。在我國棉花黃萎病重病地塊逐年增多，危害逐年加重，已成為當前實現(xiàn)棉花高 產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因素。黃萎病不僅引起作物大量減產(chǎn)和產(chǎn)品品質(zhì)降低，其致病菌產(chǎn)生的 毒素也能危害人類的健康。
[000引黃萎病主要是由大麗枝菌Ver t i C i 11 i um dah 1 iae K1 eb和黑白輪枝菌 Verticillium a化oatrum侵染引起的一種±傳維管束病害。病原菌一旦侵入植物體內(nèi)，便 沒有有效的防治方法。黃萎病菌寄主范圍廣，可W侵染包括所有雙子葉植物在內(nèi)的200多種 植物，病原菌能W微菌核的形式在±壤中存活20年左右化losterman et日1.,2009)，除 2001年Kawchuk等從番茄中克隆得到1個針對茄屬黃萎病菌的抗病基因 VeW外，幾乎沒有克 隆到來自其他植物的抗病基因，對Ve抗病基因的機制研究表明該基因只對黃萎病菌的部分 小種具有抗性(Fradin et al. ,2009)。早期的研究認為，植物感染黃萎病后，其導管被抱 子、菌絲W及病原菌通過植物細胞形成的膠狀物等堵塞而致萎黨壞死(Agrios，2005)，但 是，隨后的研究表明，導管堵塞不是黃萎病萎黨的主要原因，隨著研究的不斷深入，人們認 識到黃萎病菌產(chǎn)生的毒素是導致植物萎黨的重要因素(化adin et al. ,2006)。還有一些學 者認為，維管束的堵塞也是基于毒素的誘導效應(陳旭升等，1998)。
[0004]實踐證明，利用抗病品種是防治黃萎病危害的唯一經(jīng)濟有效的途徑。傳統(tǒng)育種方 法雖然能利用作物本身或親緣種的抗性基因選育抗病品種，但存在著可利用的抗性品種資 源少，選育時間長，耗資大等缺點；施用化學藥劑不僅難W有效防治黃萎病而且污染環(huán)境。 隨著植物基因工程技術的不斷發(fā)展W及對植物和病原物相互作用的深入了解使得將外源 抗性基因導入植物來提高抗病性成為一條有效途徑。通過轉基因技術可W打破傳統(tǒng)育種中 的種間不親和現(xiàn)象，消除雜交障礙，極大地拓寬了抗性基因的來源和應用（Grover and Gowthama,2003)。
[0005] 利用外源抗病基因產(chǎn)物抑制黃萎病菌在植株體內(nèi)的生長和繁殖可W提高植物對 黃萎病的抗性，另一方面，基于黃萎病菌毒素的致病機理，提高植物對黃萎病菌毒素的解毒 能力，也是提高植物對黃萎病抗性的有效方法之一。但是，絕大數(shù)研究者主要利用前一種方 法達到提高植物抗性的目的，尚未見成功利用外源基因的表達產(chǎn)物解毒病原菌產(chǎn)生的毒素 來提高對黃萎病抗性的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的在于提供編碼黃萎病菌P類ATTase的VdP4-ATPase基因在提高 植物對黃萎病抗性中的用途，通過將編碼黃萎病菌P類ATTase的VdP4-ATPase基因整合進入 目標植物構建轉基因植物，并使得所述VdP4-ATPase基因在植物中表達而提高植物對黃萎 病的抗性。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種提高植物對黃萎病抗性的方法，通過在目標植 物體內(nèi)表達外源基因而提高所述植物對黃萎病的抗性，所述外源基因為編碼黃萎病菌P類 AT 化 se 的 VdP4-ATPase 基因。
[0008] 具體地，本發(fā)明是將含有SEQ ID ^.9所示核巧酸序列的黃萎病菌￥(1口4-4了口曰36基 因整合入植物中，實現(xiàn)運些基因的組成型表達，提高轉基因植物對黃萎病菌毒素的解毒能 力，進而獲得抗黃萎病的轉基因植物。
[0009] 更具體地，本發(fā)明的方法，包括下述步驟：
[0010] 將VdP4-ATPase基因整合進入目標植物構建轉基因植物，并使得所述VdP4-ATPase 基因在植物中表達。
[0011] 優(yōu)選地，所述的方法，包括下述步驟：
[0012] 1)構建含有來自黃萎病菌VdP4-ATPase基因的重組植物表達載體；
[0013] 2)將所述重組植物表達載體導入目標植物中，使得VdP4-ATPase基因在目標植物 中組成型表達；
[0014] 3)獲得具有提高的抗黃萎病的轉基因植物。
[0015] 優(yōu)選地，所述￥(1?4-4了?曰36基因的核巧酸序列如569 10^.9所示。
[0016] 本發(fā)明的方法可W適用于的目標植物優(yōu)選為番茄、煙草或棉花。
[0017] 本發(fā)明方法中，步驟1)中的重組植物表達載體具有如圖4所示的結構。
[001 引
[0019] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種具有黃萎病抗性的轉基因植物的制備方法，包括 W下步驟：
[0020] i)獲得編碼黃萎病菌P類ATTase的VdP4-ATPase基因，并將其可操作地插入植物表 達載體中，構建植物表達載體；
[0021 ] i i)用步驟i)獲得的植物表達載體轉化宿主，獲得轉化體；
[0022] iii)用步驟ii)獲得的轉化體轉化植物，獲得轉基因植物。
[0023] 本發(fā)明利用黃萎病菌VdP4-ATPase基因提高植物對黃萎病抗性的方法，具體包括 如下的步驟：
[0024] 1)獲得黃萎病菌VdP4-ATPase基因：引入Spel和Smal酶切位點設計引物，然后W黃 萎病菌cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物即為添加酶切位點的VdP4-ATPase基因序列；
[00巧]2)構建組成型表達VdP4-ATPase基因的植物表達載體:將擴增獲得的VdP4-ATPase 基因序列連接入植物表達載體化GN-35S-NOS，構建一個新的植物表達載體，命名為化GN- 35S-VdP4-ATPase；
[0026] 3)植物的遺傳轉化：利用根癌農(nóng)桿菌介導法，將上述步驟2)獲得的化GN-35S- VdP4-ATPase植物表達載體整合入植物基因組，實現(xiàn)VdP4-ATPase基因在轉基因植物內(nèi)的組 成型表達，提高轉基因植物對黃萎病的抗性；
[0027] 4)抗黃萎病的VdP4-ATPase轉基因植株的獲得:將步驟3)獲得的轉基因植物進一 步進行繁殖、分子鑒定和抗病鑒定，獲得對黃萎病抗性提高的VdP4-ATPase轉基因植株。
[0028] 進一步，組成型表達的pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表達載體構建的步驟包括:獲 得黃萎病菌的cDNA后，設計上游引物:5 ' -GACTAGTATGGC TGGACGACCCACGGG(SpeI)-3 '，下游 引物5 ' -CCCCGGGTCAGGTTCCCTGTCCTTGTG (Smal) ~3 '進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物和 pLGN-35S-Nos 載體質(zhì)粒分別進行Spel和Smal雙酶切，并分別回收酶切后的大片段，再利用連接酶將回收 片段進行連接，構建一個新的植物表達載體，命名為pLGN-35S-VdP4-ATPase，W實現(xiàn)VdP4- AT化S e基因在轉基因植物內(nèi)的組成型表達。
[0029] 本發(fā)明所述的植物主要為煙草、番茄和棉花。
[0030] 前述步驟2)所述的構建組成型表達黃萎病菌VdP4-ATPase基因植物表達載體的方 法為本領域的常規(guī)方法，使用的載體為植物基因工程的常規(guī)載體，組成型表達啟動子為花 挪菜花葉病毒CaMV35S啟動子，利用其他具有組成型特性的啟動子也能達到同樣的目的。
[0031] 前述步驟3)所述的根癌農(nóng)桿菌介導的植物轉化方法，其中將植物表達載體轉入農(nóng) 桿菌的方法為電轉化法，將植物表達載體整合入煙草、番茄和棉花的方法為根癌農(nóng)桿菌介 導法。
[0032] 前述步驟4)所述的分子鑒定為分子生物學、基因工程等領域所用的鑒定技術，如 GUS組織化學染色、PCR擴增鑒定等技術。
[0033] 前述步驟4)所述的抗病鑒定是指人工氣候室或溫室內(nèi)幼苗植株對黃萎病的抗性 鑒定，轉基因煙草和番茄均采用灌菌液法進行病原菌的接種，棉花則采用浸根法進行接種。
[0034] 本發(fā)明所提供的提高植物對黃萎病抗性的方法，是將來自黃萎病菌的VdP4- ATTase基因分別轉入煙草、番茄和棉花細胞中，實現(xiàn)運些基因在轉基因植株中的組成型表 達，利用外源基因編碼的P4類ATP酶解毒黃萎病菌在植物體內(nèi)產(chǎn)生的毒素，提高轉基因植物 對黃萎病菌毒素的解毒能力，進而提高轉基因植物對黃萎病的抗病性。
[0035] 環(huán)抱菌素 A(CsA)是一種由11個氨基酸組成的親脂疏水性環(huán)膚，本發(fā)明結合了 CsA 和黃萎病菌毒素部分結構的相似性，W及黃萎病菌致病機理的特性，創(chuàng)造性地提出利用黃 萎病菌VdP4-ATPase基因在轉基因植物內(nèi)組成型表達，提高轉基因植物對黃萎病菌毒素的 解毒能力，進而提高轉基因植物對黃萎病的抗性的策略。
[0036] 本發(fā)明主要是利用轉基因產(chǎn)物對黃萎菌毒素的解毒能力提高植物抗病性，更進一 步的W相同的方式利用轉基因產(chǎn)物提高植物對真菌毒素的解毒能力也是本發(fā)明的保護范 圍。同時本發(fā)明中設及的植物表達載體，轉化細胞等也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0037] 利用本發(fā)明方法獲得的VdP4-ATPase轉基因煙草，To代幼苗利用傷根灌菌液法接 種高毒力12-1菌株30(1，病情指數(shù)為29.35，較野生型對照46.34。接種30(1，46個￥(1口4- ATTase轉化子中仍有14個轉化子沒有出現(xiàn)明顯的病癥。VdP4-ATPase轉基因棉花Τι代幼苗， 利用浸根接種法接種V991落葉型黃萎病菌株20d，非轉基因對照病情指數(shù)達到了 82.24,有 兩個VdP4-ATPase株系的病情指數(shù)低于10,分別為6.25和8.33。利用本發(fā)明獲得的轉基因番 茄To代幼苗植株利用傷根灌菌液法接種高毒力L2-1菌株，非轉基因番茄的病情指數(shù)達到 78.33，VdP4-ATPase轉基因番茄的病情指數(shù)為40.83，較野生型對照降低37.5。研究結果表 明，利用本發(fā)明方法獲得的轉基因棉花、煙草和番茄可W顯著提轉基因植物對黃萎病的抗 病性。說明，本發(fā)明提供的提高植物對黃萎病抗性的方法效果顯著。該方法不僅適用于棉 花、煙草和番茄，所有能受黃萎病菌侵染的植物均可利用該方法提高對黃萎病的抗性。
[0038] 本發(fā)明提供的方法主要是利用對病原菌毒素的解毒而提高植物的抗性，因而不具 有病原菌小種抗性的特點。因此，可W廣泛應用于提高不同病原菌生理小種的抗性，不存在 小種專一性抗性的特點。
【附圖說明】
[0039] 圖1為植物病原菌對CsA的敏感性檢測結果分析
[0040]