針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的適體的制作方法
【專利說(shuō)明】針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的適體
[0001] 本發(fā)明設(shè)及適體、適體的配體結(jié)合片段W及寡核巧酸。本發(fā)明還設(shè)及運(yùn)些劑在預(yù) 防和/或治療癌癥W及診斷癌癥中的用途。公開(kāi)的劑及方法特別地可用于腦癌諸如神經(jīng)膠 質(zhì)瘤。
[0002] 引言
[0003] 在2010年，僅在UK就有9,156例腦癌新病例(Cancer Research UK)。在世界范圍， 估計(jì)每年有445,000例腦癌新病例（Cancer Research UK)。對(duì)于被診斷為患有GBM(W冊(cè)IV 級(jí)）的患者，觀察到平均少于5%的幸存者的預(yù)后超過(guò)5年（Ohgaki和Kleihues，2005; Schwartzbaum等人，2006)。由于人口逐年增長(zhǎng)，所W腦癌的發(fā)生率將隨之增長(zhǎng)，突顯出對(duì)改 進(jìn)的診斷、預(yù)后和響應(yīng)于治療的預(yù)測(cè)的需求。在UKW及世界范圍內(nèi)，本發(fā)明均具有滿足運(yùn)一 需求的潛力。
[0004] 腦腫瘤手術(shù)的目的是最大程度去除腫瘤組織并使對(duì)周圍正常腦組織W及血管結(jié) 構(gòu)的附帶損傷Collateral damage)最小化(Thoman等人，2006)。幾項(xiàng)研究已經(jīng)證明目前的 療法受限于無(wú)效的早期診斷、藥物濃度不足W到達(dá)腫瘤、藥物毒性W及不良的治療監(jiān)控化i 等人，2009; Jiang等人，2010;Esposito等人，2011)。對(duì)于科學(xué)研究者(包括制藥產(chǎn)業(yè))來(lái)說(shuō)， 發(fā)現(xiàn)能夠僅殺死癌細(xì)胞同時(shí)不傷害正常細(xì)胞的藥物一直是個(gè)挑戰(zhàn)。用于癌癥的祀向藥物遞 送需要運(yùn)樣的自動(dòng)引導(dǎo)裝置化oming device):由于自動(dòng)引導(dǎo)裝置的受體的過(guò)表達(dá)，所述自 動(dòng)引導(dǎo)裝置可將藥物特異性地運(yùn)載至癌細(xì)胞。分子祀向已是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷和治療中的 新穎的方法之一。該方法基于鑒定可表達(dá)獨(dú)特受體或抗原的神經(jīng)膠質(zhì)瘤癌細(xì)胞群體，所述 獨(dú)特受體或抗原被用作祀向分子用于治療目的(C化iel等人，2011 ;Meyer等人，2011)。
[0005] 很多生物遞送系統(tǒng)已被選擇性地用于使用在文獻(xiàn)中受到重點(diǎn)關(guān)注的適體和單克 隆抗體將成像探針祀向腫瘤細(xì)胞化ei 1 ig，2004; Shangguan等人，2008;Cibiel等人，2011)。 由于小且高度結(jié)構(gòu)化的單鏈DNA或RNA分子的適體的高度限定的Ξ維結(jié)構(gòu)，所述Ξ維結(jié)構(gòu)有 助于所述適體W納摩爾級(jí)親和力和高特異性與其祀向的分子W高親和力結(jié)合，所W本項(xiàng)目 將使用小且高度結(jié)構(gòu)化的單鏈DNA或RNA分子的所述適體作為理想的祀向劑(Cerchia等人， 2009 ;Bayrac 等人，2011)。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了適體或該適體的配體結(jié)合片段，所述適體包含選 自由 W下組成的組的核酸序列：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、沈 Q ID N0:3、SEQ ID N0:6、 沈9 10備：7、569 10備：8、569 10備：9、569 10備：10和沈9 10備：11。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面的適體基于其結(jié)合與癌細(xì)胞相關(guān)的配體的能力來(lái)選擇。該 結(jié)合特性意味著本發(fā)明的適體在很多應(yīng)用中具有效用，所述應(yīng)用包括但不限于:治療用途、 診斷用途和研究用途。關(guān)于運(yùn)些用途的更多細(xì)節(jié)在本公開(kāi)內(nèi)容的別處列出。
[000引如由SEQ IDN0:2的適體所示例的，本發(fā)明的適體顯示出能夠跨越血腦屏障的出乎 意料且有益的特性。該特性是有優(yōu)勢(shì)的原因在于血腦屏障否則可對(duì)被施用至身體、能夠到 達(dá)大腦內(nèi)存在癌癥諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤的部位的劑(諸如治療劑或成像劑)構(gòu)成重要障礙。出乎 意料的是先前公布的結(jié)果已表明為了使適體跨越血腦屏障，必須將它們與祀向部分綴合。 本發(fā)明的適體跨越血腦屏障而不需要添加此類祀向部分的能力因此是預(yù)料不到的優(yōu)勢(shì)。
[0009] 將領(lǐng)會(huì)到有可能能夠?qū)Ρ景l(fā)明的第一方面的適體或其配體結(jié)合片段做出一些改 變，而不丟失運(yùn)些適體和片段的基本功能。因此，本發(fā)明還提供了寡核巧酸，所述寡核巧酸 與沈Q ID NO: 1至3或6至11中的任一個(gè)共有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性，其中所述寡核巧酸保留了 與所討論的適體相同的結(jié)合特性。為了簡(jiǎn)潔的目的，并且除了上下文另外需要處之外，在本 公開(kāi)內(nèi)容中提及"本發(fā)明的適體"還應(yīng)該被認(rèn)為包括基于此類適體的寡核巧酸。
[0010] 本發(fā)明的寡核巧酸的結(jié)合特性和本發(fā)明的適體的片段的配體結(jié)合性質(zhì)可例如，使 用在實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分描述的方法諸如流式細(xì)胞技術(shù)被容易地確定。對(duì)于本發(fā)明的第一方面的 寡核巧酸或適體片段的結(jié)合特性和配體結(jié)合藉W可在實(shí)驗(yàn)上被確立的其他合適技術(shù)對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。
[0011] 不偏離W上所考慮的，對(duì)于基于本文公開(kāi)的適體序列的變體，在合適的實(shí)施方案 中，本發(fā)明的第一方面的適體可由選自由W下組成的組的核酸序列組成:沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:2、沈Q ID N0:3、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、沈Q ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10和沈Q ID NO: 11。
[0012] 本發(fā)明的適體或其配體結(jié)合片段結(jié)合與癌細(xì)胞相關(guān)的配體的能力使運(yùn)些劑高度 適用于治療性應(yīng)用。技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)到本發(fā)明的適體結(jié)合與癌細(xì)胞相關(guān)的配體的能力使運(yùn) 些適體非常適用于其中希望使抗癌劑祀向腫瘤的治療性應(yīng)用。
[0013] 僅通過(guò)舉例的方式，已經(jīng)設(shè)計(jì)出許多運(yùn)樣的治療策略，其中與癌細(xì)胞的要素(例如 在此類癌細(xì)胞的表面上表達(dá)的標(biāo)志物)結(jié)合的劑被用于祀向遞送治療性有效負(fù)載。將領(lǐng)會(huì) 到本發(fā)明的適體良好適用于如此使用。
[0014] 此類實(shí)施方案可治療性地使用與抗癌劑締合的本發(fā)明的適體或其配體結(jié)合片段。 適體和抗癌劑可經(jīng)由任何合適的方式彼此締合。適體和抗癌劑可直接或間接地彼此締合。 在該上下文中，就"間接地締合"而言意指適體與載體締合，且抗癌劑與載體而不是直接與 適體本身締合。
[0015] 僅通過(guò)舉例的方式，在一個(gè)合適的實(shí)施方案中，適體和抗癌劑可彼此綴合。在合適 的實(shí)施方案中，抗癌劑可由合適的載體包封，或附接(例如共價(jià)地或非共價(jià)地)至合適的載 體。在此類實(shí)施方案中，合適的載體的實(shí)例可選自由W下組成的組:納米顆粒(諸如納米殼） 和樹(shù)枝狀聚合物。合適地，納米顆?？砂饪拱﹦┗蛴煽拱﹦┌?。樹(shù)枝狀聚合物也可包封 抗癌劑、或可使抗癌劑附接至樹(shù)枝狀聚合物的外周基團(tuán)。
[0016] 抗癌劑可W是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的期望被祀向癌細(xì)胞部位，諸如腫瘤的任何此 類劑。僅作為非限制性示例，在合適的實(shí)施方案中，抗癌劑可選自由W下組成的組:放射性 核素；納米顆粒，諸如納米殼;納米籠;基因沉默劑;和細(xì)胞毒性化合物。在合適的實(shí)施方案 中，可將本發(fā)明的適體與運(yùn)些抗癌劑的任一個(gè)或任何組合締合。
[0017] 放射性核素和細(xì)胞毒性化合物可具有殺死被祀向的癌細(xì)胞的固有能力，而納米顆 粒(諸如納米殼)或納米籠當(dāng)被照射時(shí)能夠吸收能量，W使得其溫度增加，允許它們殺死被 祀向的癌細(xì)胞-該技術(shù)有時(shí)被稱為光動(dòng)力療法。光動(dòng)力療法還可利用近紅外染料，當(dāng)被照射 時(shí)，所述近紅外染料降解W釋放能夠殺死附近細(xì)胞的活性氧(reactive 0巧gen species)。 將領(lǐng)會(huì)到運(yùn)類染料還構(gòu)成了可與根據(jù)本發(fā)明的適體締合的抗癌劑。
[0018] 基因沉默劑能夠通過(guò)干擾轉(zhuǎn)錄或翻譯來(lái)阻止或抑制基因表達(dá)的過(guò)程。取決于待沉 默的基因的性質(zhì)，基因沉默劑可具有固有的抗癌活性或可適合于被用作其他抗癌療法的輔 助物。
[0019] 基因沉默劑的合適的實(shí)例可選自由W下組成的組:siRNA分子、核酶和反義寡核巧 酸。待沉默的基因可參考所選擇的本發(fā)明的適體(與基因沉默劑締合的）與之結(jié)合的細(xì)胞的 已知特性來(lái)選擇。例如，待沉默的基因可W是編碼適體與之結(jié)合的配體的基因。
[0020] 如在本公開(kāi)內(nèi)容中別處討論的，發(fā)明人已鑒定了由SEQ ID NO: 2(也被稱為SA43或 GL43)組成的本發(fā)明的適體，SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3與Ku異二聚體中的配體化u70或 Ku80)結(jié)合。不希望被任何假設(shè)所束縛，發(fā)明人認(rèn)為被運(yùn)些適體結(jié)合的配體最有可能是 Ku70〇
[0021] 技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)到Ku異二聚體的生物學(xué)功能在于DM修復(fù)，并因此該適體將特別 地非常適合祀向已被暴露于福射或DNA損傷劑的癌細(xì)胞。
[0022] 此外，認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的適體能夠與Ku異二聚體內(nèi)的配體結(jié)合可使此類適體令人注 目地用于基因沉默劑的祀向。僅通過(guò)舉例的方式，當(dāng)包含SEQ ID N0:l、2或3的本發(fā)明的適 體(或其配體結(jié)合片段）與針對(duì)Ku70和/或Ku80的基因沉默劑締合時(shí)，此類適體可與其他抗 癌療法組合使用，在所述其他抗癌療法中使用放射性或其他DNA損傷方法殺死癌細(xì)胞。本發(fā) 明的適體有效地祀向表達(dá)Ku異二聚體的癌細(xì)胞，并然后阻止或抑制表達(dá)(并且因此抑制該 異二聚體的功能）的能力將減少DNA修復(fù)，并因此增加基于DNA損傷的療法的效果。
[0023] 因此，可期望包含SEQ ID NO: 1、2或3的適體或此類適體的配體結(jié)合片段包含阻止 或抑制Ku70和/或Ku80的基因表達(dá)的基因沉默劑。合適的基因沉默