硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物力學(xué)的重要性已被越來(lái)越多的研究者關(guān)注。生物力學(xué)的出現(xiàn)使傳統(tǒng)只針對(duì)于基因水平疾病的藥物受到了強(qiáng)有力的挑戰(zhàn)，細(xì)胞力學(xué)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)、而或細(xì)胞機(jī)械傳導(dǎo)都可能對(duì)許多的疾病發(fā)生起關(guān)鍵作用，包括動(dòng)脈粥樣硬化、纖維化、哮喘、骨質(zhì)疏松、心臟衰竭、癌癥，甚至包括廣義的醫(yī)療殘疾如過(guò)敏性腸綜合癥。研究表明，當(dāng)生長(zhǎng)在不同硬度的等價(jià)化學(xué)表面上時(shí)，有許多種類(lèi)型的細(xì)胞可以改變它們自身的形態(tài)和基因表達(dá)圖譜。細(xì)胞周?chē)奈h(huán)境為細(xì)胞提供了復(fù)雜的生物化學(xué)活性結(jié)構(gòu)和物理調(diào)控。在這種環(huán)境中，細(xì)胞通過(guò)感知細(xì)胞外基質(zhì)或相鄰細(xì)胞來(lái)主動(dòng)探測(cè)識(shí)別其所在微環(huán)境的硬度，并將其感受的機(jī)械擾動(dòng)和環(huán)境壓力傳遞到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)整自身表觀遺傳學(xué)表達(dá)。生物力學(xué)環(huán)境在胚胎發(fā)育、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和病理學(xué)中影響基因的選擇性表達(dá)，在細(xì)胞表觀遺傳學(xué)差異體現(xiàn)中起到了重要的作用。正常肝臟彈性模量不足1500帕，在這種條件下肝星形膠質(zhì)細(xì)胞可保持靜息狀態(tài)。I千帕左右的彈性模量可以保持肺成纖維細(xì)胞處于良好的生理水平。然而，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)在更硬的環(huán)境中時(shí)(如8-22千帕)就會(huì)轉(zhuǎn)變分化形成不同的表型。研究證明，持續(xù)增加的外部機(jī)械力可以誘導(dǎo)更多的細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)和基質(zhì)沉積，從而導(dǎo)致纖維化的形成，引起體內(nèi)器官系統(tǒng)功能障礙。
[0003]聚合生物材料可作為體外細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，其中生物力學(xué)性質(zhì)可調(diào)的水凝膠為研究細(xì)胞在不同軟硬刺激中對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)的條件反應(yīng)提供了有力的工具。體外模型的建立對(duì)于了解傷口愈合和疾病發(fā)病的機(jī)制有著至關(guān)重要的作用，尤其是在細(xì)胞的表型和功能發(fā)揮的研究中的更是不可或缺的。然而，大多數(shù)的生物力學(xué)研究主要集中在機(jī)械條件如何影響粘附細(xì)胞活性以及它們細(xì)胞外基質(zhì)的形成，生物力學(xué)調(diào)控細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的研究?jī)H局限在原位細(xì)胞，細(xì)胞收集對(duì)細(xì)胞的影響作用往往被研究者們所忽略。如何在不損傷細(xì)胞特性的前提下消化、重懸細(xì)胞仍然具有很大的挑戰(zhàn)性。
[0004]成功的再生醫(yī)學(xué)治療必須考慮細(xì)胞的天然特性，使得細(xì)胞能夠激發(fā)對(duì)于組織修復(fù)有利的信號(hào)通路從而融入天然的組織結(jié)構(gòu)。內(nèi)穩(wěn)態(tài)是維持細(xì)胞正常的生理功能的動(dòng)態(tài)過(guò)程，其中包括所有與細(xì)胞生存所需的內(nèi)部和外部環(huán)境。體外細(xì)胞培養(yǎng)收集技術(shù)包括酶消化和物理剝離是細(xì)胞傳代中最經(jīng)常采用的方法。傳統(tǒng)常規(guī)細(xì)胞收集方法由于酶消化蛋白水解或機(jī)械刮削分離的作用而得到的單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)會(huì)造成細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連結(jié)地?fù)p失。由于酶促消化可以極大地改變了細(xì)胞自身所處的環(huán)境，例如胰酶會(huì)強(qiáng)效裂解幾乎全部蛋白肽鏈中靠近羧基端的賴(lài)氨酸或精氨酸，所以很可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的特異性表達(dá)造成負(fù)面影響，考慮其在培養(yǎng)條件上所造成的差異(如細(xì)胞外基質(zhì)片段化)更有可能改變細(xì)胞的形態(tài)以及基因表達(dá)。研究表明胰酶消化會(huì)破壞細(xì)胞固有結(jié)構(gòu)和表觀遺傳學(xué)特征，細(xì)胞中組蛋白甲基化、乙?；浇?jīng)胰酶處理后明顯下降。物理剝離方法如細(xì)胞刮刀會(huì)顯著降低細(xì)胞的成活率，研究發(fā)現(xiàn)，物理刮剝的方法可能造成高達(dá)30%的細(xì)胞死亡。而且現(xiàn)在還不能確定這死細(xì)胞是否會(huì)釋放細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)對(duì)存活下來(lái)的細(xì)胞造成影響。值得期待的是，如果常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)不會(huì)對(duì)細(xì)胞自身表達(dá)造成干擾，由此便可區(qū)分實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否是實(shí)驗(yàn)真正想要得到的結(jié)果，而不是因?yàn)橛捎谂囵B(yǎng)技術(shù)條件所限而受到影響出現(xiàn)的假陽(yáng)性數(shù)據(jù)。
[0005]因而，目前關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的研究仍有待深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠有效用于細(xì)胞培養(yǎng)、可以非侵入性收集細(xì)胞、調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)、或者維持細(xì)胞代次間穩(wěn)定性，保存細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)免受破壞的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料。
[0007]在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料(可簡(jiǎn)稱(chēng)水凝膠)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料是由溫敏交聯(lián)材料和非溫敏交聯(lián)材料三維網(wǎng)狀交聯(lián)形成的，其中，溫敏交聯(lián)材料為選自N-異丙基丙烯酰胺、N-丙烯?；哙?、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N，N_ 二乙基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯甲基酰胺、N-環(huán)丙基丙烯酰胺、N-丙烯?；量┩?、N，N_乙基甲基丙烯酰胺、N-環(huán)丙基甲基其他可、N-乙基丙烯酰胺中的至少一種，非溫敏交聯(lián)材料為選自人工合成生物材料和天然生物材料中的至少一種，人工合成生物材料為選自丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羥基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯中的至少一種，天然生物材料為選自明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白和纖維連接蛋白中的至少一種。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的該水凝膠具有良好的硬度可控性、溫度敏感性和擴(kuò)增支持性，應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可隨所培養(yǎng)細(xì)胞需求改變硬度或通過(guò)主動(dòng)調(diào)控硬度調(diào)節(jié)細(xì)胞基因和形態(tài)表達(dá)，同時(shí)在體溫范圍內(nèi)呈疏水、團(tuán)縮狀態(tài)，當(dāng)其處于室溫時(shí)即變?yōu)橛H水、膨脹狀態(tài)，且兩種狀態(tài)可隨溫度變化可逆的改變，且在水凝膠表面貼附的細(xì)胞可反復(fù)在水凝膠表面生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)因細(xì)胞收集而間斷；另外，通過(guò)降低環(huán)境溫度可使水凝膠表面貼附的細(xì)胞主動(dòng)脫離水凝膠，從而完整的保存細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)，維持細(xì)胞特性在代次傳遞間的統(tǒng)一性，及表觀遺傳學(xué)的穩(wěn)定性。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，溫敏交聯(lián)材料為N-異丙基丙烯酰胺，非溫敏交聯(lián)材料為丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，溫敏交聯(lián)材料和非溫敏交聯(lián)材料的質(zhì)量比為1:(0.1?2.0)。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的硬度彈性模量為1帕?100千帕，優(yōu)選100?1500帕。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的相轉(zhuǎn)變臨界溫度為O?120攝氏度，優(yōu)選為4?33攝氏度。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，溫敏交聯(lián)材料和非溫敏交聯(lián)材料三維網(wǎng)狀交聯(lián)是在基底材料的表面上進(jìn)行的，其中，所述基底材料為玻片、塑料、金屬和硅膠中的至少一種，優(yōu)選為玻片、細(xì)胞培養(yǎng)皿、硅膠、PMMA、PCL中的至少一種。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，基底材料的表面預(yù)先利用甲基丙烯酸3_(三甲氧基硅烷)丙酯進(jìn)行修飾。
[0014]在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種制備前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:將溫敏交聯(lián)材料、非溫敏交聯(lián)材料和交聯(lián)劑混合，并使所得到的混合物進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，得到硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料。
[0015]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該方法工藝流程簡(jiǎn)單、可自動(dòng)化生產(chǎn)、可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)可根據(jù)實(shí)際需求制備出各種形狀的聚合物材料系統(tǒng)，如圓形、橢圓形、多邊形等，且所制得的聚合物材料系統(tǒng)厚度、大小均一，各種尺度級(jí)別(>lmm)均可實(shí)現(xiàn)，另外，制得的聚合物材料具有前面所述的聚合物材料的全部特征和優(yōu)點(diǎn)，在此不再一一贅述。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，制備前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的方法進(jìn)一步包括:將溫敏交聯(lián)材料、非溫敏交聯(lián)材料和交聯(lián)劑混合，得到預(yù)聚混合物;將預(yù)聚混合物置于基板的表面上，并在預(yù)聚混合物上覆蓋基底材料，然后使預(yù)聚混合物進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。其中，基底材料為選自玻片、細(xì)胞培養(yǎng)皿、硅膠、PMMA、PCL及各類(lèi)塑料和金屬等中的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，制備前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的方法進(jìn)一步包括:將溫敏交聯(lián)材料和部分交聯(lián)劑混合，將得到的溫敏混合物修飾于基底材料表面，得到溫敏基底材料;將非溫敏交聯(lián)材料和余量交聯(lián)劑混合，并將得到的非溫敏混合物置于基板的疏水表面上，然后將溫敏基底材料覆蓋于非溫敏混合物上，使其進(jìn)行所述交聯(lián)反應(yīng)。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將溫敏混合物修飾于基底材料表面進(jìn)一步包括:將溫敏混合物置于基底材料的表面，并于20?60攝氏度下反應(yīng)5?30分鐘或于紫外下照射10?1000秒，然后將所得基底材料進(jìn)行烘干處理。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述制備前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的方法中，交聯(lián)反應(yīng)是通過(guò)化學(xué)成膠、光學(xué)成膠、物理成膠、熱成膠、電解質(zhì)成膠中的至少一種進(jìn)行的。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，化學(xué)成膠的條件為于室溫下反應(yīng)5?30分鐘。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，光學(xué)成膠的條件為于光下照射10?1000秒，其中，光學(xué)成膠采用的光為紫外光、可見(jiàn)光、紅外光中的至少一種。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述制備前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的方法中采用的基板的表面預(yù)先利用十八烷基三氯硅烷進(jìn)行修飾，基底材料的表面預(yù)先利用甲基丙烯酸3_(三甲氧基硅烷)丙酯進(jìn)行修飾。
[0021]在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料在以下之一中的用途:a.調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)與細(xì)胞形態(tài);b.非侵入性收集細(xì)胞;c.維持細(xì)胞代次間穩(wěn)定性，保存細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)免受破壞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將上述水凝膠用于