料，然后使預(yù)聚混合物進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，具體可以為于室溫下反應(yīng)5?30分鐘或紫外下照射10?1000秒，得到硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料。在本發(fā)明的一些具體示例中，可以預(yù)先對(duì)預(yù)聚混合物進(jìn)行壓片處理，例如可以為基底材料成型法，具體地，可以為模具法，該模具法可以包括以下步驟:將預(yù)聚混合物置于基板的表面上，并在預(yù)聚混合物上覆蓋基底材料，將預(yù)聚混合物夾于中間，然后于室溫下反應(yīng)5?30分鐘或紫外下照射10?1000秒。
[0051]在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，可以預(yù)先將溫敏交聯(lián)材料修飾于基底材料的表面，然后再與非溫敏交聯(lián)材料混合，具體地，可以將溫敏交聯(lián)材料和部分交聯(lián)劑混合，接著將得到的溫敏混合物修飾于基底材料表面，得到溫敏基底材料;然后將非溫敏交聯(lián)材料和余量交聯(lián)劑混合，并將得到的非溫敏混合物置于基板的疏水表面上，然后將溫敏基底材料覆蓋于非溫敏混合物上，并使其進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)(例如于室溫下反應(yīng)5?30分鐘或紫外下照射10?1000秒)。同樣可以進(jìn)行基底材料成型法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述將溫敏混合物修飾于基底材料表面可以包括:將溫敏混合物置于基底材料的表面，并于20?60攝氏度下反應(yīng)5?30分鐘或于紫外下照射10?1000秒，然后將所得基底材料進(jìn)行烘干處理。其中，烘干處理的具體條件不受特別限制，只要能夠有效烘干即可，例如可以為常規(guī)的烘干方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇和調(diào)整。由此，能夠簡(jiǎn)單快速的將溫敏交聯(lián)材料修飾于基底材料表面。此種方法可將溫敏材料預(yù)先修飾的基底材料長(zhǎng)期儲(chǔ)存?zhèn)溆?，并用于任意所需非溫敏材料的修飾，操作?jiǎn)單，方便。
[0052]需要說明的是，本發(fā)明中采用的基板和基底材料的大小及形狀與所要獲得的水凝膠大小及形狀相對(duì)應(yīng)或相同，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際需要設(shè)計(jì)大小和形狀，從而獲得具有合適大小和形狀的水凝膠。本發(fā)明采用的基板和基底材料的具體材質(zhì)等不受特別限制，可為已知的常規(guī)材料，例如基板可以為玻片、塑料等，為了更好地實(shí)施本發(fā)明的上述方法，發(fā)明人提出了一種新的基板和基底材料，具體而言，可以預(yù)先利用十八烷基三氯硅烷對(duì)基板的表面進(jìn)行修飾，使得基板形成性能良好的疏水表面，預(yù)先利用甲基丙烯酸3-(三甲氧基硅烷)丙酯修飾基底材料的表面，以形成親水表面。在后續(xù)步驟中，制備聚合物材料的原料置于修飾后的基板的疏水表面上，且與基底材料的親水表面接觸。另外，在將溫敏交聯(lián)材料修飾于基底材料表面上的步驟中，溫敏交聯(lián)材料修飾于基底材料的親水表面上。由此，基板和基底材料的性能良好，有利于聚合物材料的制備，且制備效率較高。采用的修飾技術(shù)方法可以為表面化學(xué)修飾。由此，操作簡(jiǎn)單，方便快捷。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，交聯(lián)反應(yīng)的具體條件不受特別限制，只要能夠有效進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)即可，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，交聯(lián)反應(yīng)是通過化學(xué)成膠、光學(xué)成膠、物理成膠、熱成膠、電解質(zhì)成膠中的至少一種進(jìn)行的。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，化學(xué)成膠的條件可以為在室溫下反應(yīng)5?30分鐘。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，光學(xué)成膠的條件可以為于光下照射10?1000秒，其中，采用的光可以為紫外光、可見光、紅外光中的至少一種。由此，能夠保證交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行完全，且不會(huì)因反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)而浪費(fèi)時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)的具體方法不受特別限制，包括但不限于化學(xué)交聯(lián)法、物理交聯(lián)法、輻射交聯(lián)法、酶催化交聯(lián)法中的至少一種。
[0053]需要說明的是，本發(fā)明中使用的描述方式“室溫”是指溫度為10?35攝氏度;另外，本發(fā)明中使用的描述方式“化學(xué)成膠”、“光學(xué)成膠”、“物理成膠”、“熱成膠”、“電解質(zhì)成膠”主要是指交聯(lián)反應(yīng)的引發(fā)條件，例如“化學(xué)成膠”是指通過交聯(lián)劑作用下，大分子鏈間通過化學(xué)鍵聯(lián)結(jié)起來，形成網(wǎng)狀或體形結(jié)構(gòu)高分子的交聯(lián)反應(yīng)過程，“光學(xué)成膠”是指在光照的條件下引發(fā)交聯(lián)反應(yīng)，“物理成膠”是指通過靜電吸附、范德華力等進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，“熱成膠”是指通過熱引發(fā)交聯(lián)反應(yīng)，“電解質(zhì)成膠”是指通過電子基團(tuán)與離子作用形成絡(luò)合物進(jìn)行的交聯(lián)反應(yīng)。
[0054]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，為了使得上述制得的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料的細(xì)胞粘附性能，可以進(jìn)一步采用為生物樣品提供附著點(diǎn)的基質(zhì)處理聚合物材料表面，提高細(xì)胞附著效率。上述為生物樣品提供附著點(diǎn)的基質(zhì)不受特別限制，包括但不限于明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白和纖維連接蛋白等。具體而言，可以將上述制得的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料浸泡于含有為生物樣品提供附著點(diǎn)的基質(zhì)的溶液中一定時(shí)間，使得為生物樣品提供附著點(diǎn)的基質(zhì)吸附于硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料表面，完成水凝膠的修飾。
[0055]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述制備水凝膠的工藝條件還包括:反應(yīng)完畢后，從疏水表面分離收集保存水凝膠的步驟。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，收集聚合物材料的方法可以為挑片法，收集所得聚合物材料需要保存于純水中以保持濕潤(rùn)。具體而言，收集聚合物材料的方法可以按照以下步驟進(jìn)行:將中間含有聚合物材料的基板與基底材料置于液體(如水)中，利用前端折彎的針頭沿覆蓋水凝膠的玻片邊緣緩慢將聚合物材料與基板的疏水表面分離，聚合物材料與基底材料同時(shí)被挑起，將表面有聚合物材料的基底材料置于培養(yǎng)皿中，加水即可對(duì)聚合物材料長(zhǎng)期保存。
[0056]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該方法工藝流程簡(jiǎn)單、可自動(dòng)化生產(chǎn)、可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)可根據(jù)實(shí)際需求制備出各種形狀的聚合物材料系統(tǒng)，如圓形、橢圓形、多邊形等，且所制得的聚合物材料系統(tǒng)厚度、大小均一，各種尺度級(jí)別(>lmm)均可實(shí)現(xiàn)，另外，制得的聚合物材料具有前面所述的聚合物材料的全部特征和優(yōu)點(diǎn)，在此不再一一贅述。
[0057]在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料在以下之一中的用途:a.調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)與細(xì)胞形態(tài);b.非侵入性收集細(xì)胞;c.維持細(xì)胞代次間穩(wěn)定性，保存細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)免受破壞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將上述聚合物材料用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通過調(diào)整上述聚合物材料的硬度，可以有效調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)，且通過降低溫度即可使得細(xì)胞與水凝膠分離，實(shí)現(xiàn)非侵入性細(xì)胞收集，不僅可以有效避免現(xiàn)有胰酶消化方法收集細(xì)胞對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的傷害，收集獲得的細(xì)胞還能夠有效維持細(xì)胞代次間的穩(wěn)定性，保存細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)免受破壞。
[0058]在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:以前面所述的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料作為載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；以及通過降低溫度使細(xì)胞與硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料主動(dòng)分離以收集細(xì)胞。
[0059]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用上述方法培養(yǎng)的細(xì)胞的具體種類不受特別限制，包括但不限于以下中的至少一種:a)各種細(xì)胞系(如3T3、LX-2、WS-1等)中的任一種或幾種的混合培養(yǎng)與收集;b)各種原代細(xì)胞(如心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、上皮細(xì)胞等)中的任一種或幾種的混合培養(yǎng)與收集;c)干細(xì)胞(如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、誘導(dǎo)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等)中的任一種或幾種的混合培養(yǎng)與收集。
[0060]利用上述硬度可調(diào)節(jié)溫敏聚合物材料培養(yǎng)細(xì)胞的方法，可以包括如下步驟:將細(xì)胞與為培養(yǎng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液混合，得到混合液;再進(jìn)行如下步驟:將上述含有細(xì)胞的混合液滴加到聚合物材料表面，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)水凝膠使混合液均勻分布在聚合物材料表面，待細(xì)胞貼附于聚合物材料表面后，于37°C補(bǔ)充足夠培養(yǎng)液以便細(xì)胞生長(zhǎng)，接著，待細(xì)胞在不同硬度聚合物材料表面形成特定基因表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)后，加入低溫培養(yǎng)液(如4°C或室溫)降低聚合物材料所處環(huán)境溫度，因溫度變化導(dǎo)致聚合物材料由疏水變?yōu)橛H水、體積膨脹，從而導(dǎo)致細(xì)胞無法繼續(xù)附著繼而主動(dòng)脫離聚合物材料，以收集細(xì)胞。
[0061]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在細(xì)胞種植前，可以利用為生物樣品提供附著點(diǎn)的基質(zhì)處理聚合物材料表面，提高細(xì)胞附著效率。上述為生物樣品提供附著點(diǎn)的基質(zhì)不受特別限制，包括但不限于明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白和纖維連接蛋白等。具體而言，可以將上述制得的硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料浸泡于含有為生物樣品提供附著點(diǎn)的基質(zhì)的溶液中一定時(shí)間，使得為生物樣品提供附著點(diǎn)的基質(zhì)吸附于硬度可調(diào)節(jié)的溫敏聚合物材料表面，完成水凝膠的修飾。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，為生物樣品提供附著點(diǎn)的基質(zhì)可以為明膠。由此，能夠有效提高細(xì)胞的粘附活性。
[0062]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該方法培養(yǎng)細(xì)胞，能夠有效調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)，且通過降低溫度即可使得細(xì)胞主動(dòng)與聚合物材料分離，可以有效避免現(xiàn)有胰酶消化方法收集細(xì)胞對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的傷害，收集獲得的細(xì)胞能夠有效維持細(xì)胞代次間的穩(wěn)定性，保存細(xì)胞表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)免受破壞。
[0063]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，下面實(shí)施例中使用的細(xì)胞為:LX-2細(xì)胞:購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，老鼠原代心肌細(xì)胞:自I周大鼠心臟組織分離提取。
[0064]下述實(shí)施例中使用的聚乙二醇4000二丙烯酸酯(PE⑶A4000)可按照現(xiàn)有方法進(jìn)行合成:在氮?dú)鈼l件下，將5g聚乙二醇(PEG4000)粉末邊攪拌邊溶解于50ml 二氯甲烷溶液中，逐滴緩慢加入0.47ml的丙烯酰氯溶液和0.76ml的三乙胺溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)24h。然后，加入100ml 2mol/L的碳酸鉀溶液以洗滌，并靜置分層，收集下層二氯甲烷混合液。將二氯甲烷混