A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后經(jīng)凝膠電泳獲得食用向日葵雜交種SH363及其親本的電泳圖譜，用 于所述食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的檢測及鑒定，該檢測方法方便、快捷，操作 步驟簡單，能夠在短時間內(nèi)對大量的待測食用向日葵雜交種SH363樣品進(jìn)行快速鑒定，測 定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠、檢測費用低；
[0050] (2)本發(fā)明所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的方法，特定 選擇引物SR-366、SR-495、SR-1067和SR-1079中的任意兩種做為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使得 對所述食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的檢測及鑒定更加準(zhǔn)確可靠；
[0051] (3)本發(fā)明所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的方法，通過 優(yōu)化PCR的反應(yīng)體系對向日葵的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，更加有助于快速鑒定食用向日 葵雜交種SH363真實性和純度的方法的優(yōu)化，通過優(yōu)化的PCR的擴(kuò)增程序?qū)κ秤孟蛉湛?基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠快速準(zhǔn)確的測定待測食用向日葵雜交種SH363的真實性和 品種純度；
[0052] (4)本發(fā)明所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的方法，通過 優(yōu)化食用向日葵基因組DNA的提取步驟，獲得了純度較高的DNA，更加有利于向日葵基因組 DNA的PCR擴(kuò)增，使得對食用向日葵雜交種SH363的鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確；
[0053] (5)本發(fā)明所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的方法，通過 改進(jìn)變性聚丙烯酰胺凝膠顯影步驟，步驟簡單、安全，獲得的電泳圖譜清晰，便于對食用向 日葵雜交種SH363的品種鑒定，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0054] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中
[0055] 圖1是本發(fā)明實施例1的食用向日葵雜交種SH363以及標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和 R1843的電泳圖譜；
[0056] 圖2是本發(fā)明實施例2的食用向日葵雜交種SH363以及標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和 R1843的電泳圖譜；
[0057] 圖3是本發(fā)明實施例3的食用向日葵雜交種SH363以及標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和 R1843的電泳圖譜；
[0058] 圖4是本發(fā)明實施例4的食用向日葵雜交種SH363以及標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和 R1843的電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0059] 本發(fā)明所使用的主要試劑如下：
[0060] RNase A生產(chǎn)廠家為北京全式金生物技術(shù)有限公司，型號為GE101 ;
[0061] GelSafe核酸染料生產(chǎn)廠家為北京原平皓生物技術(shù)有限公司，型號為EP106-01 ;
[0062] 所使用的SSR引物生產(chǎn)廠家為生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0063] EasyTap Buffer for PAGE、dNTPs、EasyTap DNA Polymerase for PAGE 和 6XLoading Buffer生產(chǎn)廠家均為北京全式金生物技術(shù)有限公司、型號為AP112-02 ;
[0064] TEMED生產(chǎn)廠家為SIGMA，型號為T8133 ;
[0065] 本發(fā)明所使用的主要設(shè)備如下：
[0066] 高速冷凍離心機(jī)生產(chǎn)廠家為SIGMA、型號為3K15 ;
[0067] 電泳儀生產(chǎn)廠家為北京市六一儀器廠，型號為DYY-8C ;
[0068] 水平電泳槽生產(chǎn)廠家為北京市六一儀器廠，型號為DYCP-31E ;
[0069] 凝膠成像系統(tǒng)生產(chǎn)廠家為北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，型號為ChampGel5000。
[0070] 實施例1
[0071] 本發(fā)明所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的方法，包括如下 步驟：
[0072] (1)分別取由待測食用向日葵雜交種SH363、以及標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R1843 種植得到的向日葵真葉為材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因組DNA，具體步 驟如下：
[0073] a)取所述食用向日葵真葉10mg (約1cm2)置于裝有研磨珠 （D = 0· 6mm不銹鋼珠） 的2mL離心管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離心管置于研磨器中在30Hz條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離心管于液氮中待用；
[0074] b)取出步驟a)的離心管并加入1000 μ L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和巰基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每lOmin取出所述離 心管上下顛倒混勻一次；
[0075] c)將步驟b)反應(yīng)后的離心管放入4°C離心機(jī)中，于12000rpm下離心10min后，吸 取上清600 μ L并加入等體積的由體積比為1:1的三氯甲烷和Tris飽和酚構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離心機(jī)中，于12000rpm離心15min后，吸取上清500 μ L至2mL離心管 中，備用；
[0076] d)向步驟c)中的所述離心管中加入等體積三氯甲烷混勻，靜置3min后，放入4°C 離心機(jī)，12000rpm離心10min，吸取上清400 μ L至1. 5mL離心管中，備用；
[0077] e)向步驟d)中的所述離心管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離心機(jī)，7500rpm離心7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入lmL質(zhì)量濃度為75 %的乙 醇，搖晃離心管，充分洗滌所述沉淀，然后放入4°C離心機(jī)，7500rpm離心7min，棄去上清液， 晾干沉淀；
[0078] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 μ L的無菌ddH20溶解DNA，再加入 1 μ L的RNaseA，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0079] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進(jìn)行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0080] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 μ L用ddH20稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定0D26Q、0D2S。，并計算0D 26Q/0D2S。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[0081] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5μ L樣品DNA與等體積6XLoadingBufTer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔中， 180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型彌 散，則表明DNA已降解不可用；
[0082] (2)以步驟（1)所得的各所述基因組DNA為模板，設(shè)計引物SR-366,分別對所述基 因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0083] SR-366-F:5,-AACCAACTGAGCATTCTTGTGA-3,；
[0084] SR-366-R:5,-GCGCTAGGTTAAAGAGGACAAA-3,；
[0085] PCR反應(yīng)體系如下：
[0086] DNA 模板，30ng，1 μ L ;
[0087] 弓 I物，0·2μΜ，1μL;
[0088] 10 X EasyTap Buffer for PAGE (擴(kuò)增緩沖液，含 Mg2+)，2mM，2· 5 μ L ;
[0089] dNTPs, 2. 5mM, 2 μ L ；
[0090] Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0· 5 μ L ;
[0091] ddH20,17μ L ；
[0092] PCR擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降〇. 5°C，直至54°C，94°C變性30s，54退火30s，72°C延伸30s，進(jìn) 行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存，備用；
[0093] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到 所述食用向日葵雜交種SH363及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R1843的電泳圖譜，所述 6%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳包括如下步驟：
[0094] 所述6 %尿素變性聚丙烯酰胺凝膠成分包括：
[0095] 尿素（Urea)，420g ;
[0096] 5 X TBE, 100mL ；
[0097] 丙烯酰胺，57g
[0098] N、N' -亞甲基雙丙烯酰胺，3g ;
[0099] ddH20 定容至 1L ;
[0100] A)配制尿素6%變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr:Bis = 19:1):按照上述凝膠電泳體 系取Urea、5XTBE、丙烯酰胺、Ν、Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺和ddH20混合均勻制成膠混合液， 待充分溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì) 量濃度為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30mL，10 % APS180 μ L， TEMED80 μ L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠 凝固后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點樣孔處，玻璃板放入電泳槽， 固定在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條 件下預(yù)電泳lh，使凝膠預(yù)熱；
[0101] B)取步驟⑵獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入10yL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0· 025g，溴酚藍(lán)0· 025g，0. 5M/LEDTA2ml，去離子甲酰胺98ml)中混合均勻，95°C變性5min， 4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 μ L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電泳lh, 當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板下沿約lcm時，停止電泳，取出膠板，用ddH 20沖洗干凈后，經(jīng) 3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光激 發(fā)下并拍照。
[0102] (4)收集食用向日葵雜交種SH363及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R1843種植 得到的標(biāo)準(zhǔn)向日葵按照上述步驟（1)-(3)所獲得的電泳圖譜，將所述待測向日葵雜交種 SH363的圖譜與其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R1843的圖譜進(jìn)行比對，如圖1所示，Μ為分 子量標(biāo)準(zhǔn)，ΡρΡ2為食用向日葵雜交種SH363的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子Α436和R1843, Fi為食 用向日葵雜交種SH363,從圖中可以看到所述待測食用向日葵雜交種SH363同時具有其親 本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R1843的特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種SH363為真實的。
[0103] 實施例2
[0104] 本發(fā)明所述的快速鑒定食用向日葵雜交種SH363真實性和純度的方法，包括如下 步驟：
[0105] (1)分別取由待測食用向日葵雜交種SH363、以及標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R1843 種植得到的向日葵真葉為材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因組DNA，所述步 驟具體如下：
[0106] a)取所述食用向日葵真葉10mg (約lcm2)置于裝有研磨珠 （D = 0· 6mm不銹鋼珠） 的2mL離心管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離心管置于研磨器中在30Hz條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離心管于液氮中待用；
[0107] b)取出步驟a)的離心管并加入1000 μ L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和巰基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每lOmin取出所述離 心管上下顛倒混勻一次；
[0108] c)將步驟b)反應(yīng)后的離心管放入4°C離心機(jī)中，于12000rpm下離心10min后，吸 取上清800 μ L并加入等體積的由體積比為1:1的三氯甲烷和Tris飽和酚構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離心機(jī)中，于12000rpm離心15min后，吸取上清500 μ L至2mL離心管 中，備用；
[0109] d)向步驟c)中的所述離心管中加入等體積三氯甲烷混勻，靜置3min后，放入4°C 離心機(jī)，12000rpm離心10min，吸取上清300 μ L至1. 5mL離心管中，備用；
[0110] e)向步驟d)中的所述離心管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離心機(jī)，7500rpm離心7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入lmL質(zhì)量濃度為75 %的乙 醇，搖晃離心管，充分洗滌所述沉淀，然后放入4°C離心機(jī)，7500rpm離心7min，棄去上清液， 晾干沉淀；
[0111] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 μ L的無菌ddH20溶解DNA，再加入 1 μ L的RNaseA，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0112] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進(jìn)行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0113] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 μ L用ddH20稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定0D26Q、0D2S。，并計算0D 26Q/0D2S。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[0114] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 μ L樣品DNA與等體積6XLoading Buffer混 合，并加入到含有體積比為萬分之一 lOOOOXGelSafe核酸染