一種同時(shí)檢測(cè)異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲(chóng)的pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種非疾病診斷目的同時(shí)檢測(cè)異育銀 鯽多種寄生粘孢子蟲(chóng)的PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 粘孢子蟲(chóng)(Myxosporeans)是一類世界分布的后生動(dòng)物寄生蟲(chóng)，屬于粘體動(dòng)物門(mén)， 除少數(shù)種類寄生于兩棲類、爬行類、鳥(niǎo)類，甚至哺乳類外，大部分寄生于魚(yú)類，其中部分種類 能導(dǎo)致養(yǎng)殖魚(yú)類重大病害的發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失與生態(tài)污染。異育銀鯽是我國(guó)重要 的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類，近年來(lái)，隨著新品系的成功培育及養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷 擴(kuò)大，但隨之而來(lái)的病害也日趨嚴(yán)重，病害問(wèn)題已成為制約異育銀鯽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸 因素。
[0003] 洪湖碘泡蟲(chóng)、武漢單極蟲(chóng)、吳李碘泡蟲(chóng)、丑陋圓形碘泡蟲(chóng)是危害異育銀鯽養(yǎng)殖最為 嚴(yán)重的粘孢子蟲(chóng)。洪湖碘泡蟲(chóng)(Myxobolus honhuensis)是異育銀鯽"喉孢子蟲(chóng)病"病原體， 主要危害異育銀鯽的苗種培育，其靶組織為魚(yú)體咽部，病害爆發(fā)后在咽部形成肉眼可見(jiàn)的 孢囊，魚(yú)體主要癥狀為不食、游動(dòng)遲緩、咽部腫脹、鰓蓋外翻、眼球外凸、出血等，每年5-10月 為流行季節(jié)，5-7月為病害高發(fā)期，感染率可達(dá)60%，最高死亡率可達(dá)100%;武漢單極蟲(chóng) (Thelohanellus wuhanensis)是異育銀鯽"膚孢子蟲(chóng)病"病原體，主要危害異育銀鯽的苗種 培育，能與洪湖碘泡蟲(chóng)同期感染，其靶組織為魚(yú)體體表，在體表形成肉眼可見(jiàn)的小孢囊，使 魚(yú)體消瘦，畸形，生長(zhǎng)緩慢，甚至大規(guī)模死亡，對(duì)苗種培育造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失;吳李碘泡蟲(chóng) (M.wulii)是"腹孢子蟲(chóng)病"病原體，主要寄生于魚(yú)體的肝胰臟，形成肉眼可見(jiàn)的大孢囊，患 病魚(yú)表現(xiàn)為腹部膨大，內(nèi)臟萎縮，肝胰臟組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，甚至被孢囊完全代替，最終 導(dǎo)致魚(yú)體的死亡;丑陋圓形碘泡蟲(chóng)(M. turpisrotundus)主要寄生于異育銀鯽的鮑蓋、鮑弓、 口腔內(nèi)外、鰭條等多個(gè)器官組織內(nèi)，形成大小不一的肉眼可見(jiàn)孢囊，患病魚(yú)死亡率不高，但 嚴(yán)重影響商品魚(yú)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0004] 粘孢子蟲(chóng)具有復(fù)雜的生活史，研究表明粘孢子蟲(chóng)在魚(yú)體中的發(fā)育一般要經(jīng)過(guò)營(yíng)養(yǎng) 體和成熟孢子(孢囊)階段。在我國(guó)，粘孢子蟲(chóng)病的檢測(cè)主要以顯微鏡下可見(jiàn)成熟孢子、肉眼 可見(jiàn)孢囊為依據(jù)，而一旦粘孢子蟲(chóng)在魚(yú)體內(nèi)形成成熟的孢子或孢囊，沒(méi)有任何有效藥物能 夠滲入成熟孢子堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)外殼。因此，有必要建立一種簡(jiǎn)單快速的早期檢測(cè)方法，在粘 孢子蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)體階段進(jìn)行藥物防治，有效地防控粘孢子蟲(chóng)病的病害。
[0005] 在粘孢子蟲(chóng)的檢測(cè)方面，以顯微鏡觀察成熟孢子為基礎(chǔ)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，雖然 操作簡(jiǎn)便，但存在檢測(cè)滯后、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低、易于漏檢等問(wèn)題；以抗原與抗體反應(yīng)為基礎(chǔ) 的免疫學(xué)檢測(cè)方法，雖然具有靈敏性高、能進(jìn)行早期檢測(cè)的特點(diǎn)，但由于粘孢子蟲(chóng)生活史中 存在期、屬特異性抗原以及共同抗原，交叉反應(yīng)嚴(yán)重，增加了種特異性檢測(cè)的難度；以PCR技 術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法具有較高的特異性與靈敏性，已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于寄生蟲(chóng)的 早期檢測(cè)中。
[0006] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，于一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加 入多對(duì)特異性引物，針對(duì)多個(gè)模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)，可 用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體。該方法不僅能早期檢測(cè)，靈敏性高，特異性強(qiáng)，而且同普通PCR方 法相比具有省時(shí)省力、簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)同時(shí)對(duì)異育銀鯽寄生的多種粘孢 子蟲(chóng)進(jìn)行早期檢測(cè)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于異育銀鯽寄生粘孢子蟲(chóng)早期檢測(cè)方法的缺乏，本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)四種 寄生于異育銀鯽的粘孢子蟲(chóng)的PCR方法，該方法靈敏性高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，有利于異育 銀鯽的養(yǎng)殖，能夠產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
[0008] 上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種非疾病診斷目的同時(shí)檢測(cè)異育銀鯽多種寄生粘孢子蟲(chóng)的PCR方法，包括以下 步驟：
[0010] (l)DNA提取:剪取異育銀鯽皮膚、鰓、咽及肝胰臟四個(gè)部位的部分組織，混合后置 于研缽中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后提取組織樣品DNA;
[0011] (1)特異性DNA片段擴(kuò)增：分別以丑陋圓形碘泡蟲(chóng)的18S rRNA、吳李碘泡蟲(chóng)與洪湖 碘泡蟲(chóng)的ITS1-5.8S-ITS2、武漢單極蟲(chóng)的28S rRNA基因?yàn)榉肿影袠?biāo)，各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引 物，分別命名為Mtl8S F/R、MwITS F/R、MhITS F/R、Tw28S F/R;將四對(duì)引物置于單個(gè)PCR反 應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)增四種粘孢子蟲(chóng)的特異性基因片段；
[0012] (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小進(jìn)行結(jié)果判定，其中：擴(kuò)增 出894bp條帶的是丑陋圓形碘泡蟲(chóng)，590bp的是吳李碘泡蟲(chóng)，447bp的是洪湖碘泡蟲(chóng)，245bp的 是武漢單極蟲(chóng)，
[0013]所述的四對(duì)特異性引物序列分別為：
[0014] Mtl8S F:5'-ACCAGATATTTCGAGGAGTCGTTG-3'
[0015] Mtl8S R:5'-TTCCACAACGTTGCTATATAGCCA-3'
[0016] MwITS F:5'-GCCGTACATGAATTGAGGCTTGAC-3'
[0017] MwITS R:5'-TGCTCACAACGTTAACTCGAACC-3'
[0018] MhITS F:5'-ACGACCAATATATGAAATTGTTTCTCGA-3'
[0019] MhITS R:5'-TTCATTCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC-3'
[0020] Tw28S F:5'-TTTGTAAAATTCTTAACGCTGGCTAA-3'
[0021] Tw28S R:5 '-TCGAAACGCCAAAACTACGTCA-3 '。
[0022] 優(yōu)選地，步驟(2)中的PCR反應(yīng)體系為：
[0023] DNA擴(kuò)增模板2yL、10XPCR Buffer 2.5yL、25mM Mg2+3.0yL、2.5mM dNTPs4yL、5UAi L TaqDNA聚合酶0.2yL，Mtl8S F/R各0.8yL、MwITS F/R各0.4yL、MhITS F/R各0.6yL、Tw28S F/R各0.4yL，滅菌 ddH20補(bǔ)足至 25yL。
[0024] 優(yōu)選地，步驟（2)中的PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C退火 30s，72°C 延伸 7〇8,35個(gè)循環(huán)；72°(：延伸71^11，4°(：保存。
[0025] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0026] 本發(fā)明以粘孢子蟲(chóng)的183以祖、1了31-5.83-1了32及283冰熟基因?yàn)榉肿影袠?biāo)，具 有較高的特異性與靈敏性，三種分子靶標(biāo)各具特點(diǎn)，其中18S rRNA基因序列長(zhǎng)度適中、信息 充足，運(yùn)用最為廣泛；28S rRNA基因片段長(zhǎng)，包含相對(duì)較多的變量，適合用于不同階元的分 析研究；ITS屬于非編碼序列，中間被5.8S rRNA基因分開(kāi)，進(jìn)化速度快，具有可變性，尤其適 用于同屬近緣物種的區(qū)別和鑒定。
[0027]本發(fā)明方法特異性強(qiáng)，靈敏性高，可以檢測(cè)粘孢子蟲(chóng)的早期階段；同時(shí)，與普通PCR 檢測(cè)方法相比，能夠在單個(gè)PCR管中進(jìn)行一次反應(yīng)檢測(cè)丑陋圓形碘泡蟲(chóng)、吳李碘泡蟲(chóng)、洪湖 碘泡蟲(chóng)與武漢單極蟲(chóng)，省時(shí)省力，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益。
【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1:四對(duì)引物平衡濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中的電泳帶分別為:M:Marker DL2000; 1 -12分別代表反應(yīng)體系中四對(duì)引物的添加濃度：1:0.8、0.8、0.4、0.4μΜ2:0.8、0.4、0.6、0.4μ L;3:0.8、0.4、0.4、0.6yL;4:0.6、0.8、0.4、0.4yL ;5:0.4、0.8、0.6、0.4yL;6:0.4、0.8、0.4、 0.6yL;7:0.6、0.4、0.8、0.4yL;8:0.4、0.6、0.8、0.4yL ;9:0.4、0.4、0.8、0.6yL;10:0.6、0.4、 0.4、0.841^11:0.4、0.6、0.4、0.841^12:0.4、0.4、0.6、0.84以各引物工作濃度均為1(^]\1 ;每 組從左至右分別為:Mtl8S F/R、MwITS F/R、MhITS F/R、Tw28S F/R);l-12均以四種粘孢子 蟲(chóng)混合DNA為模板。
[0029]圖2 : Mg2 +、dNTP、TaqDNA聚合酶平衡濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中的電泳帶分別為：Μ: Marker DL2000; 1:2.0、2.0、0.2yL;2:3.0、2·0、0·3μΜ3:4·0、2·0、0·4μΜ4:2·0、3·0、0·3μ L;5:3.0、3.0、0.4uL;6:4·0、3·0、0·2uL;7:2·0、4·0、0·4uL;8:3·0、4·0、0·2uL;9:4·0、4·0、 0·3μLΧ 每組從左至右分別是 Mg2+(25mM)、dNTPs(2.5mM)、TaqDNA 聚合酶（5UAiL));l-9 均以四 種粘孢子蟲(chóng)混合DNA為模板。
[0030] 圖3:不同反應(yīng)退火溫度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中的電泳帶分別為:M:Marker DL2000;l-6 分別代表反應(yīng)退火溫度為55、56、57、58、59、60 °C ; 7:空白對(duì)照。
[0031]圖4:四重PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。a:丑陋圓形碘泡蟲(chóng);b:吳李碘泡蟲(chóng);c:洪湖碘泡蟲(chóng)； d:武漢單極蟲(chóng)。圖中的電泳帶分別為:M: Marker DL2000 ;l:a，b，c，d;2:a，b，c;3:a，b，d;4: 13，(：，(1;5:&，13;6:&，(3;7:&，(1;8:13，(3;9:13，(1;10:(3，(1混合0祖；11:&;12:13;13:(3;14:(