一種用MspI檢測人胃癌易感基因IL-1RN多態(tài)性rs9005的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用MspI檢測人胃癌易感基因 IL-1RN多態(tài)性 rs9005的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一 種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500~1000個堿基 對中就有1個，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。CAPs ( c 1 eaved ampl ification polymorphism sequence-tagged sites)CAPs技術(shù)又稱為PCR-RFLP，限制性片段長度多態(tài) 性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術(shù)。PCR-RFLP的基本原理是用PCR擴增目的DNA，擴增產(chǎn)物再 用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制 性酶切位點分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。此項技術(shù)大大提高了目的DNA的含量 和相對特異性，而且方法簡便，分型時間短。這種方法與RFLP相比，不同的是以擴增替代了 酶切，避免了 RFLP繁瑣的DNA酶切、轉(zhuǎn)移、雜交等步驟。
[0003] 全世界范圍內(nèi)，胃癌仍然是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。胃癌的發(fā)生是 一個多步驟，多因素，多階段，多種機制共同作用的結(jié)果，包括基因因素，生物因素以及多種 環(huán)境危險因素。盡管近年來胃癌的死亡率已有顯著的下降，但胃癌的五年生存率依舊很低。 炎癥反應與腫瘤關(guān)系的研究一直是相關(guān)學者關(guān)注的熱點，大量研究結(jié)果表明胃部幽門螺桿 菌感染與胃慢性炎癥關(guān)系密切。幽門螺桿菌感染與免疫系統(tǒng)的細胞因子尤其是白介素家族 顯著相關(guān)。越來越多的研究結(jié)果表明炎性細胞因子，如IL-1，IL-1R1以及TNF-α可以顯著地 影響胃癌的易感性。因此，研究胃癌基因遺傳多樣性很有必要。作為一類重要的細胞因子， IL-1家族基因可參與廣泛的生理過程，其中一個重要的角色是調(diào)節(jié)急性以及慢性炎癥性疾 病。IL-1在啟動和增強對幽門螺桿菌感染的反應方面起著關(guān)鍵作用，同時也發(fā)揮著非常強 的抑制胃酸分泌作用，而長期的抑制胃酸分泌作用是導致胃粘膜萎縮等癌前病變的主要原 因。許多研究發(fā)現(xiàn)IL-1基因家族的基因多態(tài)性與胃癌易感性相關(guān)。近年來IL-1RN在腫瘤領(lǐng) 域的研究取得了較大進展，但其在胃癌領(lǐng)域的研究開展相對較少，因此將一定功能相關(guān)的 IL-1RN位點多態(tài)性與胃癌結(jié)合起來可以更好的探討其對胃癌形成過程的作用，揭示其與胃 癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)性進而探討其中的具體分子機制。
[0004] 序列特異性引物PCR也稱等位基因特異性PCR(AS-PCR)，它的原理是基于Taq DNA 多聚酶不能修復DNA引物在3'末端的單個堿基錯配。所以，當引物的3'端核苷酸與等位基因 變異部位序列互補，則模板被擴增。但是，當引物3'端核苷酸與模板錯配，則模板不會被擴 增或擴增效率極低。每個等位基因的檢測，需設計兩套引物，一套為等位基因特異性引物， 一套為普通引物。PCR產(chǎn)物凝膠電泳以后，DNA的存在與否通過紫外線透射來檢測，DNA條帶 的存在或缺失即可確定基因型。在同一反應中的另一對引物(通常擴增人生長激素基因的 一段）總會產(chǎn)生一個DNA片斷，與ΗΡΑ基因型無關(guān)，作為PCR有效性的控制?；蛱禺愋訮CR (AS-PCR)的缺點是擴增效率較低，擴增特異性差，因此PCR產(chǎn)物的特異性與穩(wěn)定性無法保 障，同時，分型結(jié)果也較容易誤判，穩(wěn)定性較差。
[0005] TaqMan探針法是指PCR擴增時在加入一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光 探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5'端標記有熒光 報告基團（Reporter，R)，如FAM、VIC等，3'端標記有熒光淬滅基團（Quencher，Q)，如TAMRA 等。當探針完整的時候，5'端報告基團經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3'端熒光基 團淬滅，儀器檢測不到5'端報告基團所激發(fā)的熒光信號（就是說5'熒光基團的發(fā)射波長正 好是3'熒光基團的吸收波長，因而能量被吸收傳遞到3'熒光基團而發(fā)出其它熒光）。隨著 PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5' -3'外切酶活性(此活性是 雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會將切割探針，釋放5'端報告基團游離于反應 體系中，遠離3'端熒光淬滅基團的屏蔽，5'端報告基團受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號就可以被 探頭檢測到。也就是說每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積 與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。
[0006] Taqman熒光探針法需要昂貴的儀器和較長的步驟，成本較高，難以在實驗室中普 及使用。
[0007] 染料法基因定性分析方法的缺點在于由于染料法特異性不強，只要是雙鏈的DNA 都會結(jié)合發(fā)光，因此，特異性較差。
[0008] 綜上所述，為了最終實現(xiàn)降低胃癌的發(fā)病率，本領(lǐng)域迫切需要胃癌易感基因，并開 發(fā)操作簡單、成本低、適用范圍廣泛的檢測胃癌易感基因的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用MspI檢測人胃癌易感基因 IL-1RN多態(tài)性rs9005的方法，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法， 是采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目的DNA片段，然后將待檢測的DNA片段用限制性內(nèi)切酶 酶切，限制性內(nèi)切酶識別并切割特異的序列，然后將酶切后的產(chǎn)物進行電泳，再由限制酶圖 譜(restriction map)分析此段序列的特異切位點，藉由片段的多樣性來比對不同來源基 因序列的差異性。簡而言之，就是先PCR擴增相應目的片斷，而后進行限制性內(nèi)切酶切反應， 電泳后觀察比較限制性圖譜來分析序列之間的差異。此方法重復性好，操作較簡單，成本 低，酶切結(jié)果容易辨識。因此，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、成本低、適用范圍廣泛的 檢測人胃癌易感基因 IL-1RN多態(tài)性rs9005的方法及檢測試劑盒。
[0010]其技術(shù)方案如下：
[0011] 一種用MspI檢測人胃癌易感基因 IL-1RN多態(tài)性rs9005的方法，包括以下步驟： [0012] (a)抽提樣品的基因組DNA;
[0013] (b)提供擴增人IL-1RN基因多態(tài)性rs9005位點附近序列的正向引物和反向引物， 獷89005上游弓|物：5'-6〇八(：1^6八6八(：1^丁八丁6-3'，獷89005下游弓|物：5'-GTGAGGCTGAAGGAAGAA-3 '，以步驟(a)提取的待測人基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲取擴 增產(chǎn)物；
[0014] (c)使用限制性內(nèi)切酶對(b)中獲取的擴增產(chǎn)物進行酶切，獲取相應的酶切產(chǎn)物；
[0015] (d)將酶切產(chǎn)物采用3%的瓊脂糖凝膠進行電泳，以判定IL-1RN基因多態(tài)性rs9005 的各基因型。其中，經(jīng)電泳后有一條條帶者為AA基因型，兩條條帶者為GG基因型，三條條帶 者為GA基因型。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0017] 本發(fā)明旨在提供一種操作簡單、成本低、適用范圍廣泛的檢測人胃癌易感基因 IL-1RN多態(tài)性rs9005的方法。研究發(fā)現(xiàn)rs9005帶有A基因型(尤其是AG基因型）的個體胃癌的發(fā) 病風險顯著高于帶有GG基因型個體。在此背景下提供此方便、快捷的檢測人胃癌易感基因 IL-1RN多態(tài)性rs9005的方法有望預測胃癌的易感性，可用于臨床的早期診斷。
【附圖說明】
[0018] 圖1是PCR擴增反應程序；
[0019] 圖2是IL-1RA rs9005位點的電泳圖譜；
[0020]圖3是IL-1RN rs9005位點GG基因型測序圖譜(反向測序）；
[0021]圖4是IL-1RN rs9005位點AA基因型測序圖譜(反向測序）；
[0022] 圖5是IL-1RN rs9005位點GA基因型測序圖譜(反向測序）。