單鏈核酸分子。
[0054]本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述核酸酶是以所述單鏈核酸分 子為底物的核酸酶。
[0055] 本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述結(jié)合核酸分子負(fù)載在載體上 并且是與單鏈核酸分子的雜交體的形式，所述單鏈核酸分子包含與所述結(jié)合核酸分子互補(bǔ) 的序列，并且通過與所述靶標(biāo)接觸，所述雜交體中的所述結(jié)合核酸分子與所述靶標(biāo)形成復(fù) 合物并且釋放所述單鏈核酸分子。
[0056] 本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述核酸酶是核酸外切酶。
[0057] 本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，作為所述酶的底物的所述核酸單 體是腺苷核苷酸，其可以是，例如，核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸中的至少一種。
[0058] 本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述酶是具有熒光素酶活性的蛋 白質(zhì)，并且其具體實(shí)例是熒光素酶。
[0059] 本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，其還包括試劑，并且所述試劑是使 得信號通過與以所述單體為底物的酶反應(yīng)而產(chǎn)生的試劑，或者是使得信號通過與以所述單 體為底物的酶反應(yīng)而消失的試劑。
[0060] 本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述信號是光信號和電信號中的 至少一種。
[0061] 本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述載體是珠或平板。
[0062] (靶標(biāo)分析方法）
[0063] 如上所述，本發(fā)明的靶標(biāo)分析方法是用于分析靶標(biāo)的分析方法，其包括:使得與所 述靶標(biāo)結(jié)合的結(jié)合核酸分子與樣品彼此接觸以形成所述結(jié)合核酸分子與所述樣品中所述 靶標(biāo)的復(fù)合物的復(fù)合物形成步驟;通過核酸酶處理將核酸單體從復(fù)合物級分和非復(fù)合物級 分中的至少一個釋放的核酸酶處理步驟;使釋放的核酸單體與以所述核酸單體為底物的酶 進(jìn)行反應(yīng)的酶處理步驟;檢測所述酶反應(yīng)的檢測步驟;和根據(jù)檢測所述酶反應(yīng)的結(jié)果分析 已經(jīng)形成了所述復(fù)合物的所述靶標(biāo)的分析步驟。在本發(fā)明中，術(shù)語"分析"是包括，例如定量 分析、半定量分析和定性分析的概念。
[0064] 在復(fù)合物形成步驟中，對結(jié)合核酸分子沒有特別地限定，只要其與靶標(biāo)結(jié)合即可。 例如，結(jié)合核酸分子也被稱為適體。
[0065] 對靶標(biāo)沒有特別地限定，并且可以選擇任何靶標(biāo)。那么，取決于所選擇的靶標(biāo)，可 以使用與靶標(biāo)結(jié)合的結(jié)合核酸分子。靶標(biāo)的實(shí)例包括微生物、病毒、低分子量化合物、食物 變應(yīng)原、農(nóng)藥和真菌毒素。
[0066] 例如，結(jié)合核酸分子可以是單鏈或雙鏈，并且優(yōu)選是單鏈。對結(jié)合核酸分子的長度 沒有特別地限定。其下限是，例如，堿基長度為18、20、或24,并且其上限是，例如，堿基長度 為120、60、或26。
[0067] 在復(fù)合物形成步驟中，對樣品沒有特別地限定。例如，樣品可以是含有靶標(biāo)的樣品 或者對于其來說不知道存在或不存在靶標(biāo)的樣品。優(yōu)選地，例如，樣品是液體樣品。
[0068]在核酸酶處理步驟中，例如，可以僅對復(fù)合物級分進(jìn)行核酸酶處理，可以僅對非復(fù) 合物級分進(jìn)行核酸酶處理，或者可以對復(fù)合物形成步驟中的反應(yīng)體系（即，含有復(fù)合物級分 和非復(fù)合物級分的混合體系)進(jìn)行核酸酶處理。
[0069] 在僅對復(fù)合物級分或僅對非復(fù)合物級分進(jìn)行核酸酶處理的情況下，優(yōu)選的是，本 發(fā)明包括在所述復(fù)合物形成步驟之后且在核酸酶處理步驟之前的將所述復(fù)合物級分和所 述非復(fù)合物級分與用于所述復(fù)合物形成的反應(yīng)體系分離的分離步驟。
[0070] 對用于將復(fù)合物級分和非復(fù)合物級分分離的方法沒有特別地限定。例如，通過將 復(fù)合物與一個或多個載體結(jié)合并且通過收集所述一個或多個載體來收集復(fù)合物級分，可以 將復(fù)合物級分和非復(fù)合物級分分離。例如，載體和復(fù)合物可以彼此直接結(jié)合，或者它們可以 彼此間接結(jié)合。在前一種情況中，例如，可以使用適用于事先負(fù)載結(jié)合核酸分子的一個或多 個載體。在這種情況下，形成了負(fù)載在一個或多個載體上的結(jié)合核酸分子和靶標(biāo)的復(fù)合物， 由此可以將復(fù)合物與一個或多個載體直接結(jié)合。在后一種情況中，例如，可以使用負(fù)載與靶 標(biāo)結(jié)合的結(jié)合物質(zhì)的一個或多個載體。在這種情況下，形成了靶標(biāo)和結(jié)合核酸分子的復(fù)合 物，并且復(fù)合物中的結(jié)合核酸分子與負(fù)載在一個或多個載體上的結(jié)合物質(zhì)結(jié)合，由此可以 將復(fù)合物與一個或多個載體經(jīng)由結(jié)合物質(zhì)間接結(jié)合。
[0071]對載體沒有特別地限定，并且其可以是，例如，珠或容器如平板。對結(jié)合物質(zhì)沒有 特別地限定，并且其實(shí)例包括結(jié)合核酸分子和針對上述結(jié)合核酸分子的抗體。
[0072] 當(dāng)使用載體時，對用于將復(fù)合物級分和非復(fù)合物級分分離的方法沒有特別地限 定，并且其實(shí)例包括固液分離。當(dāng)使用容器作為載體時，通過從容器收集液體級分，可以提 供容器中的剩余級分作為復(fù)合物級分并且可以提供收集的液體級分作為非復(fù)合物級分。當(dāng) 使用珠作為載體時，通過將反應(yīng)體系分離為固體級分和液體級分，可以提供前者作為復(fù)合 物級分并且可以提供后者作為非復(fù)合物級分。例如，可以過濾、離心、靜置等實(shí)現(xiàn)固體級分 和液體級分的分離。
[0073] 在本發(fā)明包括分離步驟并且對復(fù)合物級分進(jìn)行核酸酶處理的情況下，本發(fā)明還可 以包括，例如，在分離步驟和核酸酶處理步驟之間的洗滌復(fù)合物級分的步驟。通過洗滌復(fù)合 物級分，例如，可以抑制被未參與復(fù)合物形成的未反應(yīng)的結(jié)合核酸分子污染，由此具有更高 準(zhǔn)確性的分析成為可能。
[0074] 在核酸酶處理步驟中，對核酸酶沒有特別地限定，只要其是將核酸單體從多核苷 酸釋放的酶即可。例如，核酸酶優(yōu)選是將核酸單體從多核苷酸的末端釋放的核酸外切酶。核 酸單體的釋放可以多核苷酸的3'端或5'端開始。核酸外切酶的實(shí)例包括蛇毒核酸酶、脾磷 酸二酯酶、RNA酶H、BAL31、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶VII和λ核酸外切酶。核 酸酶可以是，例如，作用于RNA的核糖核酸酶、作用于DNA的脫氧核糖核酸酶、或作用于RNA和 DNA二者的核酸酶。
[0075] 對要被核酸酶切割的核酸單體沒有特別地限定，并且其可以是，例如核苷酸殘基。 核苷酸殘基中的糖殘基可以是，例如核糖殘基或脫氧核糖殘基。當(dāng)糖殘基是核糖殘基時，核 苷酸殘基是核糖核苷酸殘基。當(dāng)糖殘基是脫氧核糖殘基時，核苷酸殘基是脫氧核糖核苷酸 殘基。對核苷酸殘基中的堿基沒有特別地限定，并且其實(shí)例包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸 腺嘧啶和尿嘧啶。對核苷酸殘基中的磷酸基團(tuán)沒有特別地限定，并且其可以是，例如單磷酸 或二磷酸。核酸單體的具體實(shí)例包括AMP和脫氧-AMP(dAMP)。
[0076] 在酶處理步驟中，對酶沒有特別地限定，只要其是催化與作為底物的核酸單體的 反應(yīng)的蛋白質(zhì)即可。對酶沒有特別地限定，并且其可以是，例如，具有熒光素酶活性的蛋白 質(zhì)，并且優(yōu)選熒光素酶。
[0077] 例如，根據(jù)核酸酶處理步驟中要切割的核酸單體的類型，可以適當(dāng)?shù)卦O(shè)定酶。
[0078] 例如，在酶處理步驟中，酶反應(yīng)可以在試劑的存在下進(jìn)行。試劑可以是，例如，使得 信號通過與作為底物的核酸單體的酶反應(yīng)而產(chǎn)生的試劑，或者是使得信號通過與作為底物 的核酸單體的酶反應(yīng)而消失的試劑。例如，信號可以是光信號或電信號。
[0079] 對進(jìn)行核酸酶處理步驟和酶處理步驟的順序沒有特別地限定。酶處理步驟可以在 核酸酶處理步驟之后進(jìn)行，或者兩個步驟可以同時進(jìn)行。
[0080] 例如，優(yōu)選的是，本發(fā)明的分析方法還包括將核酸酶處理步驟中切割的核酸單體 轉(zhuǎn)化為在其中磷酸基團(tuán)為三磷酸的核苷酸。例如，具體地，當(dāng)在核酸酶處理步驟中具有單磷 酸或二磷酸的核苷酸作為核酸單體被切割時，在轉(zhuǎn)化處理步驟中將核酸單體轉(zhuǎn)化為具有三 磷酸的核苷酸。當(dāng)分析方法還包括轉(zhuǎn)化處理步驟時，可以進(jìn)一步提高靈敏度。
[0081] 在轉(zhuǎn)化處理步驟中，使用例如用于將具有單磷酸或二磷酸的核苷酸轉(zhuǎn)化為具有三 磷酸的核苷酸的轉(zhuǎn)化酶，可以實(shí)現(xiàn)向具有三磷酸的核苷酸的轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)化酶沒有特別地限 定，并且其實(shí)例包括丙酮酸正磷酸雙激酶。
[0082] 當(dāng)在轉(zhuǎn)化處理步驟中將核酸單體轉(zhuǎn)化為具有三磷酸的核苷酸時，優(yōu)選的是使用在 酶處理步驟中具有三磷酸的核苷酸為底物的酶。作為具有三磷酸的核苷酸為底物的酶，例 如，可以使用熒光素酶等。
[0083] 對進(jìn)行核酸酶處理步驟、轉(zhuǎn)化處理步驟和酶處理步驟的順序沒有特別地限定。它 們可以按此順序進(jìn)行；核酸酶處理步驟和轉(zhuǎn)化處理步驟可以同時進(jìn)行;轉(zhuǎn)化處理步驟和酶 處理步驟可以同時進(jìn)行;或這三個步驟可以同時進(jìn)行。
[0084]在檢測步驟中，對由酶引起的酶反應(yīng)的檢測沒有特別地限定?？梢酝ㄟ^，例如，直 接或間接檢測由酶反應(yīng)引起的底物的減少，完成檢測。間接檢測是，例如，對由酶反應(yīng)產(chǎn)生 的信號的檢測。作為具體實(shí)例，信號可以是，例如通過酶反應(yīng)由試劑產(chǎn)生的信號。例如，信號 可以是光信號或電信號。
[0085] 光信號可以是，例如，如發(fā)光、熒光、顯色等的信號。例如，可以通過發(fā)光、熒光、顯 色等的視覺觀察來檢測光信號。備選地，可以通過光學(xué)方法檢測發(fā)光強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度、吸光 度、反射率等作為信號。
[0086]例如，電信號可以是電流等。例如，可以通過電學(xué)方法檢測電信號。
[0087]分析步驟是根據(jù)檢測步驟中檢測酶反應(yīng)的結(jié)果分析復(fù)合物級分中含有的靶標(biāo)的 步驟。檢測酶反應(yīng)的結(jié)果可以是，例如，檢測針對復(fù)合物級分進(jìn)行的酶反應(yīng)、針對非復(fù)合物 級分進(jìn)行的酶反應(yīng)、或針對復(fù)合物形成步驟中的反應(yīng)體系（即，含有復(fù)合物級分和非復(fù)合物 級分的混合體系)進(jìn)行的酶反應(yīng)的結(jié)果。
[0088] 以下將參照作為具體實(shí)例的下列實(shí)施方案描述本發(fā)明的分析方法:其中將復(fù)合物 級分和非復(fù)合物級分分離的實(shí)施方案1，其中不將兩種組分分離的實(shí)施方案2,以及其中使 用各自由結(jié)合核酸分子和包含與結(jié)合核酸分子互補(bǔ)的序列的單鏈核酸分子組成的雜交體 的實(shí)施方案3。然而，應(yīng)指出的是，本發(fā)明決不限于這些示例性實(shí)施方案。除非另外說明，每 個實(shí)施方案中的描述也適用于其他實(shí)施方案。
[0089] (1)實(shí)施方案1
[0090] 如上所述，本發(fā)明的實(shí)施方案1涉及一個方面，其中在復(fù)合物形成步驟之后，將復(fù) 合物級分和非復(fù)合物級分與復(fù)合物形成步驟中的反應(yīng)體系分離。例如，可以給出以下要描 述的實(shí)施方案1A、1B和1C作為實(shí)例。
[0091] 首先，本發(fā)明的實(shí)施方案1A涉及一個方面，其中對復(fù)合物級分進(jìn)行核酸酶處理。具 體地，實(shí)施方案1A的分析方法包括:使得與靶標(biāo)結(jié)合的結(jié)合核酸分子與樣品彼此接觸以形 成結(jié)合核酸分子與樣品中靶標(biāo)的復(fù)合物的復(fù)合物形成步驟;將復(fù)合物級分和非復(fù)合物級分 與用于復(fù)合物形成的反應(yīng)體系分離的分離步驟;通過核酸酶處理將核酸單體從復(fù)合物級分 釋放的核酸酶處理步驟;使釋放的核酸單體與以