一種早期肝癌診斷試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種早期肝癌診斷試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]HCC是全球最常見的惡性腫瘤之一，因病情進(jìn)展快、預(yù)后差、早期診斷困難、治療手段有限而死亡率高。糖蛋白鏈參與細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫監(jiān)視，維持著多細(xì)胞生物體內(nèi)各項(xiàng)有序生命活動(dòng)，因而糖鏈的異常改變通常與多種疾病包括腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
[0003]相比于目前診斷肝癌的各種成像技術(shù)，比如超聲檢查，計(jì)算機(jī)斷層掃描，磁共振成像等，這些技術(shù)不能分辨良性的肝變化，例如發(fā)育不良的結(jié)節(jié)和硬化的大結(jié)節(jié)與肝癌的區(qū)另|J。業(yè)內(nèi)主要選擇血清腫瘤標(biāo)志物來檢測惡性腫瘤，而血清甲胎蛋白(AFP)作為唯一被廣泛應(yīng)用于診斷及復(fù)查肝癌的血清標(biāo)志物，最近的分析顯示AFP檢測的靈敏度和特異性都有較大的波動(dòng)范圍，而且這些波動(dòng)并不完全由于使用了不同的截止水平的閾值效應(yīng)。目前，在臨床上缺乏靈敏、特異的早期肝癌診斷標(biāo)志物，能檢測出的早期肝癌病例大約占所有肝癌病例的25%。因此，可以快速簡便準(zhǔn)確檢測肝癌和跟蹤檢測肝癌治療效果的檢測產(chǎn)品具有十分廣闊的市場。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種可快速簡便準(zhǔn)確檢測早期肝癌診斷試劑盒及其使用方法。
[0005]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種早期肝癌診斷試劑盒，包括Gl:5% SDS, G2:2.2單位/ μ L糖酰胺酶，G3A: 10mM三磺酸三鈉鹽熒光標(biāo)記物，G3B:1Μ有機(jī)物還原劑，G4:唾液酸酶，Gff:去離子水。
[0006]優(yōu)選的所述Gl的容積是90 μ L，G2的容積是54 μ L，G3A的容積是18 μ L，G3B的容積是18 μ L，G4的容積是36 μ L，Gff的容積是3.6mL。
[0007]一種早期肝癌診斷試劑盒的使用方法，包括下列步驟:(1)在試管中先加入2 UL的樣本血清，再加入5 μ LGl，使用漩渦振蕩器充分混勻，在95°C PCR加熱5分鐘進(jìn)行高溫變性處理再冷卻到4°C得到樣品；(2)在所述樣品中加入3yL的G2，混勻離心，在培養(yǎng)箱中37°C保持3小時(shí)再冷卻到4°C，對冷卻后的樣品加入50 μ L的GW終止反應(yīng)可低溫保存；
(3)取10μ L低溫保存的樣品在金屬浴中干燥90分鐘，再冷卻到4°C，對干燥后的樣品加入2 μ L按體積比1:1配置的G3A和G3B的混合液，離心處理，并在培養(yǎng)箱中37°C保持16小時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記再冷卻到4°C，再加入100 μ L的GW進(jìn)行終止反應(yīng)，混勻離心后可低溫保存；
(4)取2yL終止反應(yīng)后樣本加入2 yLG4，混勻離心，在培養(yǎng)箱中37°C保持16小時(shí)，再加入40 μ L的GW終止反應(yīng)，混勻離心后取樣10 μ L通過基因測序儀進(jìn)行N-寡糖鏈片段分離檢測，余液可低溫保存。
[0008]優(yōu)選的所述步驟(2)、(3)和⑷中的低溫保存溫度是_20°C。
[0009]優(yōu)選的所述步驟(2)、(3)和⑷中的終止反應(yīng)時(shí)長是I分鐘。
[0010]本發(fā)明具有積極的效果:通過對唾液酸酶的反應(yīng)時(shí)間、濃度、溫度進(jìn)行調(diào)控，節(jié)省時(shí)間成本，縮短了整個(gè)反應(yīng)周期，提高生產(chǎn)效率；原材料經(jīng)濟(jì)適用，利于規(guī)模擴(kuò)大化生產(chǎn)；可以有效降低AFP(甲胎蛋白)對于肝癌的漏診率，保證了可觀的準(zhǔn)確率。
【具體實(shí)施方式】
[0011]本發(fā)明試劑盒使用方法是通過高溫使蛋白變性，游離出所需要的寡糖，并通過在寡糖末端加上帶電荷的熒光基團(tuán)，以增加其靈敏度，并實(shí)現(xiàn)可選擇的分離，采用基因測序儀ABI3500分析并測量樣本中熒光標(biāo)記的N-寡糖鏈的含量或指紋圖譜(簡稱G-Test圖譜)，分析比較N-寡糖各組分的峰高，利用方程計(jì)算出NA3F/ (NA2F+NA2FB)比值。
[0012]試劑盒只需要一滴血，通過運(yùn)用基于糖蛋白糖鏈檢測的肝癌療效評價(jià)技術(shù)，一般僅需要2，3天就可以準(zhǔn)確的檢測出肝癌情況，同時(shí)對于未患肝癌的肝臟進(jìn)行健康評估，能準(zhǔn)確、快速、方便的檢測肝癌發(fā)病情況，清晰的療效評價(jià)指標(biāo)對于病情發(fā)展有著重要的作用，在檢測過程中靈敏度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，具有安全無損傷，快速簡捷等特點(diǎn)。
[0013]這種早期肝癌診斷試劑盒，包括Gl:5% SDS，90yL/M;G2:2.2單位/yL糖酰胺酶，54 μ L/瓶；G3A: 10mM三磺酸三鈉鹽熒光標(biāo)記物，18 μ L/瓶；G3B:1M有機(jī)物還原劑，18 μ L/瓶；G4:唾液酸酶，36 μ L/瓶；GW:去離子水，3.6mL/瓶，其中的 Gl，G2，G3A，G3B，G4，Gff均為無色透明的液體，均在4°C下保存，其中G3A與G3B需避光保存，有效期為一個(gè)月，對于肝癌的檢測準(zhǔn)確度達(dá)到85%。
[0014]使用方法的步驟包括:(I)在試管中先加入2 yL的樣本血清，再加入5 yLGl，使用漩渦振蕩器充分混勻，在95°C PCR加熱5分鐘進(jìn)行高溫變性處理再冷卻到4°C得到樣品；(2)在所述樣品中加入3 μ L的G2，混勻離心，在培養(yǎng)箱中37 °C保持3小時(shí)再冷卻到4°C，對冷卻后的樣品加入50 μ L的GW終止反應(yīng)I分鐘可低溫_20°C保存；(3)取10 μ L低溫保存的樣品在金屬浴中干燥90分鐘，再冷卻到4°C，對干燥后的樣品加入2 μ L按體積比1:1配置的G3A和G3B的混合液，離心處理，并在培養(yǎng)箱中37°C保持16小時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記再冷卻到40C，再加入100 μ L的GW進(jìn)行終止反應(yīng)I分鐘，混勻離心后可低溫_20°C保存；(4)取2 μ L終止反應(yīng)后樣本加入2 μ LG4，混勻離心，在培養(yǎng)箱中37°C保持16小時(shí)，再加入40 μ L的GW終止反應(yīng)I分鐘，混勻離心后取樣1yL通過基因測序儀進(jìn)行N-寡糖鏈片段分離檢測，余液可低溫_20°C保存。
[0015]以上所述的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種早期肝癌診斷試劑盒，其特征在于:包括Gl:5% SDS，G2:2.2單位/μ L糖酰胺酶，G3A: 10mM三磺酸三鈉鹽熒光標(biāo)記物，G3B:1Μ有機(jī)物還原劑，G4:唾液酸酶，Gff:去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的早期肝癌診斷試劑盒，其特征在于:所述Gl的容積是90μ L，G2的容積是54 μ L，G3A的容積是18 μ L，G3B的容積是18 μ L，G4的容積是36 μ L，Gff的容積是3.6mL。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述的早期肝癌診斷試劑盒的使用方法，包括下列步驟:(I)在試管中先加入2 yL的樣本血清，再加入5 μ LGl，使用漩渦振蕩器充分混勻，在95 °C PCR加熱5分鐘進(jìn)行高溫變性處理再冷卻到4°C得到樣品；(2)在所述樣品中加入3 yL的G2，混勻離心，在培養(yǎng)箱中37°C保持3小時(shí)再冷卻到4°C，對冷卻后的樣品加入50 μ L的GW終止反應(yīng)可低溫保存；(3)取10 μ L低溫保存的樣品在金屬浴中干燥90分鐘，再冷卻到4°C，對干燥后的樣品加入2 μ L按體積比1:1配置的G3A和G3B的混合液，離心處理，并在培養(yǎng)箱中37°C保持16小時(shí)進(jìn)行焚光標(biāo)記再冷卻到4°C，再加入100 μ L的GW進(jìn)行終止反應(yīng)，混勾離心后可低溫保存；(4)取2 μ L終止反應(yīng)后樣本加入2 μ LG4，混勻離心，在培養(yǎng)箱中37°C保持16小時(shí)，再加入40 yL的GW終止反應(yīng)，混勻離心后取樣10 μ L通過基因測序儀進(jìn)行N-寡糖鏈片段分離檢測，余液可低溫保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的早期肝癌診斷試劑盒的使用方法，其特征在于:所述步驟(2)、(3)和(4)中的低溫保存溫度是-20 °C。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的早期肝癌診斷試劑盒的使用方法，其特征在于:所述步驟(2)、(3)和(4)中的終止反應(yīng)時(shí)長是I分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種早期肝癌診斷試劑盒，包括G1：5％SDS，G2：2.2單位/μL糖酰胺酶，G3A：100mM三磺酸三鈉鹽熒光標(biāo)記物，G3B：1M有機(jī)物還原劑，G4：唾液酸酶，GW：去離子水；還公開了試劑盒的使用方法；解決了甲胎蛋白對于肝癌的漏診率高的問題；可以快速簡便準(zhǔn)確檢測肝癌和跟蹤檢測肝癌治療效果。
【IPC分類】G01N33-574
【公開號(hào)】CN104807998
【申請?zhí)枴緾N201510240451
【發(fā)明人】陳翠英
【申請人】先思達(dá)（南京）生物科技有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月12日