肉鴨細(xì)小病毒精制卵黃抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種肉鴨細(xì)小病毒精制卵黃抗體，主要涉及抗體領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]2014年11月以來，我國部分地區(qū)肉鴨流行一種以臨床癥狀為鴨喙發(fā)育不良，舌頭外露、腫脹、向下彎曲，發(fā)病率為10-30%，鴨發(fā)病日齡集中在2個(gè)階段，第一階段為3?13日齡，癥狀為站立不穩(wěn)，蹼外翻，強(qiáng)行驅(qū)趕時(shí)跛行或翻滾;第二階段為21?28日齡，主要為運(yùn)動(dòng)障礙，跟不上大群，呈蹲坐式或側(cè)臥，并表現(xiàn)出舌頭外露癥狀，患病鴨料肉比比正常鴨高30%以上，同日齡出欄體重比正常鴨低20%以上，且發(fā)育不整齊，屠宰時(shí)易翅膀和腿骨折為特征的疾病。禽病專家刁有祥等最先分離到病原，基因序列鑒定與鵝細(xì)小病毒同源性大于98%，與番鴨細(xì)小病毒同源性為77%左右，命名為鴨細(xì)小病毒。常規(guī)治療方法基本無效，對鴨養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003 ]針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出一種的肉鴨細(xì)小病毒精制卵黃抗體。
[0004]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0005]第一步，將分離得到的肉鴨細(xì)小病毒經(jīng)易感鴨胚傳代12代獲得作為毒種，然后將得到的肉鴨細(xì)小病毒用生理鹽水20000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種11日齡易感鴨胚，0.1ml/胚，收集接種60?120小時(shí)死亡鴨胚尿囊液，無菌檢驗(yàn)合格后得到抗原；
[0006]第二步，抗原加終濃度為0.1%甲醛，37°C滅活24小時(shí)；于4°C經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集上清液，上清液用超濾器濃縮15倍，濃縮液轉(zhuǎn)入滅菌容器滅活檢驗(yàn)合格后得到制備疫苗用抗原制備疫苗用抗原加入鴨白細(xì)胞介素2，使鴨白細(xì)胞介素2終濃度為5yg/ml，即為鴨細(xì)小病毒白細(xì)胞介素2佐劑滅活疫苗，無菌操作分裝，于2?8 °C保存；
[0007]第三步，選取商品蛋雞進(jìn)行抗原接種和收集高免雞蛋，對高免雞蛋進(jìn)行消毒、分離卵黃、抗體的萃取和過濾。
[0008]進(jìn)一步，第一步中得到的抗原，要進(jìn)行病毒含量、純凈性、特異性和免疫原性進(jìn)行鑒定。
[0009]進(jìn)一步，抗原用生理鹽水10倍系列稀釋，取10—5、10—6和10—73個(gè)稀釋度接種9日齡易感鴨胚，每個(gè)稀釋度各接種5枚，每一胚胎0.1ml，用蠟封孔，于37.5 V靜置孵化，24小時(shí)以前死亡的鴨胚棄去不計(jì)，收集24?168小時(shí)死亡鴨胚，按Reed-Muench法計(jì)算病毒含量為10一6.25ELD50A).lml。
[0010]進(jìn)一步，免疫原性按如下進(jìn)行免疫接種:
[0011]對100?110日齡商品蛋30只進(jìn)行接種，同時(shí)設(shè)10只對照，不做任何處理，免疫程序如下:
[0012]基礎(chǔ)免疫每只雞腿部肌肉注射1.0ml。
[0013]加強(qiáng)免疫在基礎(chǔ)免疫后21日進(jìn)行第2次接種，每只雞胸部肌肉注射1.5ml。
[0014]強(qiáng)化免疫在加強(qiáng)免疫后15日進(jìn)行第3次接種，每只雞頸背部皮下注射2.0ml。
[0015]進(jìn)一步，選取100-120日齡蛋雞進(jìn)行滅火抗原接種:維持免疫:當(dāng)卵黃中鴨細(xì)小病毒瓊擴(kuò)抗體效價(jià)臨界I: 32時(shí)，維持接種I次，每只雞頸背部皮下注射疫苗2.0ml。強(qiáng)化免疫后7日，抽樣取蛋，分離卵黃，提取抗體，檢測鴨細(xì)小病毒瓊擴(kuò)抗體效價(jià)大于等于I: 32為合格，收集高免雞蛋，8?12°C貯存，應(yīng)不超過10日。
[0016]進(jìn)一步，充分?jǐn)嚢枋孤腰S呈均勻膏狀，裝入滅菌攪拌罐中，按體積比1:3加入25°C左右、pH為4.7的滅菌注射用水，攪拌30分鐘，將卵黃液轉(zhuǎn)入不銹鋼桶中，加入終濃度為4%正辛酸，繼續(xù)攪拌30分鐘，室溫放置12?24小時(shí)，用40目濾網(wǎng)撇去漂浮在上層的蛋黃，用80目濾布過濾，收集濾液，濾出液和下層液體合并，用板框過濾器加濾板和0.4微米濾膜過濾，然后轉(zhuǎn)入用0.2%甲醛溶液消毒的500L冰柜中，4°C冷藏5小時(shí)，使殘留的辛酸結(jié)晶凝結(jié)析出，用80目濾網(wǎng)撇去浮在上層的辛酸結(jié)晶，用0.2M氫氧化鈉溶液調(diào)pH7.0，再后用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液調(diào)節(jié)PH6.9，即為抗體半成品。
[0017]進(jìn)一步，抗體半成品加入終濃度0.05%甲醛，用過濾精度0.2μπι的筒式濾芯過濾除菌。
[0018]本發(fā)明的有益效果如下:將本技術(shù)方案正確的運(yùn)用，用于預(yù)防，可阻斷病毒感染，臨床保護(hù)率大于93%以上;用于治療，在發(fā)病3-5日以內(nèi)及時(shí)使用抗體治療，鴨體重低于Ikg的，按1.5ml/只；大于Ikg體重以上的，按1.2ml/kg體重。一般用藥I次，3天后病鴨臨床發(fā)病癥狀消失，配合抗生素來控制細(xì)菌繼發(fā)感染效果更佳，小于10日齡發(fā)病的商品雛鴨愈后發(fā)育良好、后期出現(xiàn)喙短、舌頭外翻癥狀的比例小于10%，基本不影響經(jīng)濟(jì)價(jià)值;但發(fā)病日齡超過10天的，對已形成喙短舌頭突出的癥狀不能逆轉(zhuǎn)。本發(fā)明制備的肉鴨細(xì)小病毒精制卵黃抗體為臨床預(yù)防、治療該病提供了有效手段，能顯著減少該病給肉鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例
[0020]I肉鴨細(xì)小病毒白細(xì)胞介素2佐劑滅活疫苗制備
[0021]K1抗原制備
[0022]肉鴨細(xì)小病毒，由公司研究人員于2015年I月從山東聊城某肉鴨養(yǎng)殖場分離到的肉鴨細(xì)小病毒，經(jīng)易感鴨胚傳代12代、鑒定獲得。肉鴨細(xì)小病毒用生理鹽水20000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種11日齡易感鴨胚，0.1ml/胚，收集接種60?120小時(shí)死亡鴨胚尿囊液，無菌檢驗(yàn)合格，即為抗原，于-40 °C保存。同時(shí)取樣用于鑒定。
[0023]1.2抗原鑒定
[0024]1.2.1病毒含量
[0025]抗原用生理鹽水10倍系列稀釋，取10—5、10—6和10—73個(gè)稀釋度接種9日齡易感鴨胚，每個(gè)稀釋度各接種5枚，0.1ml/胚，用蠟封孔，于37.5 °C靜置孵化，24小時(shí)以前死亡的鴨胚棄去不計(jì)，收集24?168小時(shí)死亡鴨胚，按Reed-Muench法計(jì)算病毒含量為10—6.25ELD5q/0.1ml。
[0026]1.2.2純凈性
[0027]抗原按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行細(xì)菌、支原體和外源病毒檢驗(yàn)合格。
[0028]1.2.3特異性
[0029]抗原用生理鹽水稀釋至200ELD5Q/0.1ml，與等量抗肉鴨細(xì)小病毒特異性血清混合，37 0C水浴中和I小時(shí)，尿囊腔接種9日齡易感鴨胚1枚，0.1ml /胚；同時(shí)設(shè)病毒對照1枚，接種同條件處理的病毒與生理鹽水混合液0.1ml/枚，上述鴨胚用蠟封孔，于37°C靜置孵育，觀察至168小時(shí)。中和組鴨胚全部健活，對照組鴨胚全部死亡。說明抗原能被抗肉鴨細(xì)小病毒特異性血清中和。
[0030]1.2.4免疫原性
[0031]1.2.4.1抗原滅活
[0032]抗原加終濃度為0.1 %甲醛，37°C滅活24小時(shí)，期間振搖4次，每次3分鐘。
[0033]1.2.4.2滅活檢驗(yàn)
[0034]1.2.4.2.1無菌按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。
[0035]1.2.4.2.2安全檢驗(yàn)滅活抗原皮下或肌肉注射5日齡肉鴨10只，1.0ml/每只。飼養(yǎng)觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。
[0036]1.2.4.2.3免疫接種
[0037]滅活抗原按如下免疫程序接種100?110日齡商品蛋30只，同時(shí)設(shè)1只對照，不做任何處理，免疫程序如下:
[0038]基礎(chǔ)免疫每只雞腿部肌肉注射1.0ml。
[0039]加強(qiáng)免疫在基礎(chǔ)免疫后21日進(jìn)行第2次接種，每只雞胸部肌肉注射1.5ml。
[0040]強(qiáng)化免疫在加強(qiáng)免疫后15日進(jìn)行第3次接種，每只雞頸背部皮下注射2.0ml。
[0041]1.2.4.2.4抗體提取
[0042]強(qiáng)化免疫后10日分別收集雞蛋，分離卵黃，按組混合，攪拌成膏狀，加入3倍體積的生理鹽水，充分?jǐn)噭?，加入終濃度20 %的氯仿，劇烈震蕩20分鐘，于4°C條件下4000rpm離心20分鐘，收集上清液，過濾除菌即為抗體樣品。
[0043]1.2.4.2.5瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測用抗原的制備
[0044]抗原300ml加入終濃度為20%的氯仿，劇烈振搖20分鐘，于4°C條件下4000rpm離心20分鐘，收集上清液，過濾除菌，濾液加入透析袋中，用夾子夾緊，放在直接15cm的平皿上，在透析袋上撒PEG2000，而后放入密封玻璃缸中，于4 °C濃縮，期間根據(jù)情況更換PEG2000，至透析袋內(nèi)液體全部無為止，用滅菌生理鹽水洗去透析袋外附著的PEG2000，在透析袋內(nèi)加入6ml生理鹽水，夾上夾子，將其內(nèi)壁充分清洗，吸出液體，轉(zhuǎn)入1ml滅菌管制瓶中，加入終濃度0.1 %甲醛，于室溫滅活24小時(shí)，分裝，裝量0.2ml/管，-20 °C保存，即為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測用抗原。
[0045]1.2.4.2.6抗體效價(jià)檢測
[0046]按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)法檢測抗體樣品中鴨細(xì)小病毒特異性抗體效價(jià)。結(jié)果為:試驗(yàn)組瓊擴(kuò)抗體效價(jià)為I:16,對照組中和抗體效價(jià)<1:2。結(jié)果說明抗原的免疫原性良好。
[0047]1.3肉鴨細(xì)小病毒白細(xì)胞介素2佐劑滅活疫苗制備
[0048]抗原加終濃度為0.1 %甲醛，37 °C滅活24小時(shí)(期間振搖4次，每次3分鐘)。于4°C經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集上清液，上清液用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維超濾器濃縮15倍，濃縮液轉(zhuǎn)入滅菌容器，于4°C保存，取樣按1.2.4.2進(jìn)行滅活檢驗(yàn)合格，即為制備疫苗用抗原。
[0049]制備疫苗用抗原加入鴨白細(xì)胞介素2，使鴨白細(xì)胞介素2終濃度為5yg/ml，即為鴨細(xì)小病毒白細(xì)胞介素2佐劑滅活疫苗，無菌操作分裝，于2?8°C保存。取樣按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)合格。
[0050]2鴨細(xì)小病毒精制卵黃抗體制造及檢驗(yàn)[0051 ] 2.1高免雞蛋的生產(chǎn)