Hla-a0201限制性抗muc-1抗原特異性ctl的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用研究領(lǐng)域，設(shè)及HLA-A0201限制性抗MUC-1抗原特 異性CTL制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] -、腫瘤治療的困境與機會
[0003] 惡性腫瘤已成為人類第一號"殺手"，手術(shù)、放療與化療是治療腫瘤的Ξ大常規(guī)方 法，能在短期內(nèi)有效的減輕腫瘤負荷，但仍不能有效清除腫瘤細胞。微小殘留病灶、對放療、 化療的部分敏感和耐藥是腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的根源，而復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移正是腫瘤患者死亡的主要 原因。常規(guī)治療方法已力不從屯、，開發(fā)新型的腫瘤治療技術(shù)與產(chǎn)品迫在眉睫。
[0004] 二、細胞免疫治療技術(shù)的誕生與發(fā)展
[0005] 上世紀(jì)80年代起免疫學(xué)與腫瘤學(xué)的迅速發(fā)展，1982年美國NIH Rosenberg教授為 首的研究小組研制出淋己因子活化的殺傷細胞(LAK)免疫療法，并在后續(xù)研究中對LAK細胞 的臨床應(yīng)用進行了深入的探討。但是LAK細胞殺傷力不夠強，臨床應(yīng)用需要大量輸注（3 X l〇iwi)，另一方面擴增能力有限，需要在輸注細胞的同時大劑量應(yīng)用白細胞介素-2(化-2) (10萬IU/kg，q她），因而產(chǎn)生了相關(guān)的不良反應(yīng)。而后Rosenberg又提出了腫瘤浸潤淋己細 胞(TIL)，其殺瘤能力較LAK有了明顯提高，并且無需大劑量IL-2聯(lián)合應(yīng)用，但細胞需要從腫 瘤組織中分離獲得，運極大限制其廣泛的臨床應(yīng)用。在W上的工作基礎(chǔ)上，1991年Stanford 大學(xué)的Schmidt-Wolf等采用干擾素丫（IFN-丫）、IL-2和鼠抗人CD3單克隆抗體（Mouse anti-Human CD3mAb)共同誘導(dǎo)出了具有強大抗腫瘤活性的細胞群，命名為細胞因子誘導(dǎo)的 殺傷細胞(CIK)。
[0006] 樹突狀細胞（DCs)是迄今為止已知的體內(nèi)功能最為強大的專職抗原遞呈細胞 (APC)，其表面存在豐富的抗原捕獲分子，抗原遞呈分子(MHC I類和MHCn類分子），免疫共 刺激分子(CD80、CD83、CD86、CD40等）。經(jīng)抗原刺激后的DC細胞向淋己結(jié)遷移，將其攜帶的抗 原信息傳遞給相應(yīng)的T淋己細胞，啟動、激發(fā)CD4+/CD8巧細胞免疫應(yīng)答，特異性地殺滅腫瘤 細胞。同時經(jīng)抗原刺激后的DCs可分泌白細胞介素-8(比-8)、干擾素 a(IFN-a)、白細胞介素- 12(化-12)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)等，增強機體非特異性免疫應(yīng)答(天然免疫），故DC有"天 然免疫佐劑"的美稱，其發(fā)現(xiàn)者Ralph Steinman教授獲得2011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。鑒于DC在機 體免疫防御系統(tǒng)中所處的中屯、地位，基于DC開發(fā)的抗腫瘤疫苗已使之成為最先進、最有希 望的腫瘤免疫治療技術(shù)之一，近年來國內(nèi)外學(xué)者對其進行了廣泛的探索。1992年Stanford 醫(yī)學(xué)院的2位教授成立了世界上第一家WDC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗公司(〇611化6〇11，〔4)，該公司 的產(chǎn)品Provenge已于2010年4月29日獲得抑A批準(zhǔn)上市。但是DC在體內(nèi)的功能受到患者本身 免疫狀態(tài)，腫瘤微環(huán)境的影響，而腫瘤患者體內(nèi)存在大量抑制因子，因此DC的體內(nèi)效果并不 如體外效果理想。
[0007] 細胞毒性T淋己細胞(CTL)構(gòu)建是近期興起的免疫治療技術(shù)，因其具有特異、直接 殺傷腫瘤祀細胞的能力，因此成為研究的熱點。
[0008] S、MUC-1在腫瘤免疫治療中的作用
[0009] MUC-1粘蛋白家族成員，又稱為多形上皮粘蛋白（poly-mo;rphic epithelial mucin，PEM)、上皮膜抗原（邱ithelial membrane antigen，EMA)、CD227及CAl53等，其相對 分子量大于400000,是一種主要分布于腺上皮細胞的跨膜糖蛋白，分為細胞外區(qū)、跨膜區(qū)和 胞內(nèi)區(qū)。
[0010] 在惡性腫瘤組織中，如乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤組織中， MUC-1的表達存在質(zhì)與量的異常，主要體現(xiàn)在表達量增高為正常的10倍W上，且增加的程度 與腫瘤的惡性程度成正比，極性分布消失，整個腺上皮細胞表面均表達MUC-1，胞漿中也表 達，糖鏈的糖基化不全，導(dǎo)致膚鏈表位暴露，使MUC-1成為可被免疫系統(tǒng)識別的腫瘤抗原。
[0011] MUC-1是最先與機體免疫系統(tǒng)接觸的細胞表面分子之一，它幾乎表達于所有的上 皮細胞腺癌中，且MUC-1可W通過非人類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性及Μ肥限制性 兩種方式誘導(dǎo)活化CTL，殺傷表達MUC-1的腫瘤細胞，因而MUC-1是腫瘤主動特異性免疫治療 理想的祀分子。
[0012]因此，開發(fā)新型針對MUC-1祀點的特異性CTL是一種發(fā)展方向。
[OOU] 四、CTL作用機理
[0014] 1、機體T細胞免疫反應(yīng)過程
[001引機體存在龐大的T細胞庫，通過其表面表達不同的T細胞受體(TCR)特異識別不同 的外部抗原分子(細菌、病毒和腫瘤抗原多膚），被活化為具有殺滅祀細胞的CTL，清除細菌、 病毒的感染和腫瘤細胞，且能產(chǎn)生免疫記憶性CTL，防止細菌、病毒的再次入侵和腫瘤的復(fù) 發(fā)。
[0016] CTL免疫應(yīng)答大致分四個階段：
[0017] (1)抗原識別:APC通過表面受體識別并捕獲抗原(細菌、病毒、腫瘤細胞）；
[0018] (2)抗原加工與遞呈：抗原經(jīng)APC消化、裂解成多膚分子，后者與APC胞內(nèi)豐富的 MHC-I類或Π 類分子結(jié)合分別形成MHC-I-多膚或MHC-II-多膚復(fù)合物，并被轉(zhuǎn)運至APC表面； [0019] (3)Τ細胞激活(雙信號學(xué)說）:APC與T細胞相遇，T細胞通過自身TCR識別APC遞呈的 MHC-I/II-多膚復(fù)合物，其中CD8巧細胞識別MHC-I-多膚復(fù)合物，CD4巧細胞識別Μ肥-II-多 膚復(fù)合物，Τ細胞接受了抗原的刺激信號（第一信號）加上免疫共刺激信號（第二信號)開始 活化，具有細胞毒性作用即CTl;
[0020] (4)祀細胞殺滅：活化CTL循環(huán)至抗原所在部位，通過CTL表面的TCR特異識別抗原 表達細胞后進行殺傷和清除。
[0021] 但，已發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)存在大量免疫抑制因子，影響CTL的有效活化和增殖，數(shù) 量甚少，不足W與迅速增殖的腫瘤抗衡。若能在體外制備大量抗原特異性CTL并回輸給患 者，可直接、快速殺傷腫瘤細胞起到治療作用，對常規(guī)治療無法清除的殘留腫瘤細胞進行殺 滅，將可W防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
[0022] 2、CTL表型與功能差異
[0023] 根據(jù)CTL表面分子的表達種類可分為兩型：中央記憶型CTL(CTL-gm)和效應(yīng)記憶型 CTL(CTL-em)〇
[0024] Klebanoff等研究發(fā)現(xiàn)：表型分析為CD3+CD45R0+CD6化+CCR7+的C化-CM具有更強的 抗腫瘤能力；Johnson等比較了 MART-1TCR基因修飾的CTL-?和CTL-EM，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者消退惡 性黑色素瘤細胞的能力是后者的10倍。Berger等研究結(jié)果還顯示CTLgm輸注后較表型為CDS +CD45RO+CD62kCCR7-的CTL-em在體內(nèi)能存活更長的時間。
[0025] 3、CTL技術(shù)開發(fā)現(xiàn)狀
[0026] 綜合國內(nèi)、國外CTL體外制備技術(shù)可歸類為Ξ種方法與來源：
[0027] (1)腫瘤浸潤淋己細胞(TIL)體外擴增法
[00%]從腫瘤患者腫瘤組織中分離TIL，加入白細胞介素-2(化-2)培養(yǎng)，克隆稀釋法篩選 腫瘤抗原陽性的T細胞克隆，再加入鼠抗人CD3單克隆抗體和IL-2進行擴增培養(yǎng)獲得。
[0029] Li等選擇HLA-A201陽性的IV期惡性黑色素瘤患者，將其腫瘤組織制備成單細胞懸 液后，加入比-2培養(yǎng)，5周后篩選擴增細胞中CD8巧+MART-1+的陽性T細胞克隆，再加入鼠抗 人CD3單克隆抗體和福照后的PBMC飼養(yǎng)細胞擴增培養(yǎng)，次日加入IL-2,再培養(yǎng)12天可獲得 CTLs，能對負載MART-1多膚的T2細胞株特異性識別和殺傷。
[0030] (2)TCR基因修飾法
[0031] TCR是T細胞識別抗原、介導(dǎo)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子，包括α、β、丫、δ四條鏈，由二硫鍵 連接成α/β和丫作兩種異二聚體，其中α/β巧細胞占外周血Τ細胞的90-95%，是主要的免疫 效應(yīng)細胞。TCR基因修飾即通過外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染自體Τ淋己細胞，導(dǎo)入能識別特異性抗原多膚 的TCR基因，挑選陽性克隆，在體外擴增培養(yǎng)獲得CTL。較為常用的質(zhì)粒有逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)?；?慢病毒質(zhì)粒。
[0032] Morgan等采用抗CD3+CD28+磁珠激活CD8巧細胞，應(yīng)用慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染修飾MART-1 或gplOO特異性的TCR基因，采用鼠抗人CD3單克隆抗體和IL-2培養(yǎng)體系制備CTLs，在12天能 擴增培養(yǎng)至1〇9個細胞，用于15例HLA-A化的黑色素瘤患者的治療，結(jié)果顯示有2例患者出現(xiàn) 了明顯的臨床療效，1例52歲男性患者的蔽窩轉(zhuǎn)移病灶消失，肝轉(zhuǎn)移病灶縮小了 89%，無病 生存期為21個月；1例30歲男性患者，肺部轉(zhuǎn)移病灶消失，無病生存期為20個月。
[0033] Perro等采用白細胞介素-15(IL-15)和白細胞介素-2UIL-21)細胞因子組合促進 TCR基因轉(zhuǎn)染非增殖的T細胞，可W維持T細胞高表達CD6化和CD28。
[0034] (3)體外抗原致敏法
[0035] 用人工APC(Artificial APC)，或抗原(蛋白質(zhì)，多膚，或全細胞)體外反復(fù)刺激T細 胞，獲得抗原特異性CTL。
[0036] 浙江大學(xué)的發(fā)明專利（專利號:CN102168066A)體外誘導(dǎo)乙型肝炎病毒特異性細胞 毒性T淋己細胞的方法即采用該方法。將MHC-1-Ig和抗CD28mAb包被磁珠構(gòu)建人工APC，抗原 表位膚負載APC后，體外致敏3-4周，再W磁珠吸附分離抗原特異性CTUTetramer染色鑒定。
[0037] 上述Ξ種方法的缺陷：
[003引 （l)TIL體外擴增法
[0039] ①需要獲得患者的新鮮腫瘤組織作為CTL來源，僅限于可手術(shù)的患者，且腫瘤組織 來源有限；
[0040] ②TIL分離，CTL克隆的獲取與鑒定方法復(fù)雜，腫瘤組織中各種細胞成分較多，較復(fù) 雜，分離細胞的時間長，一般都需要1個月W上；
[0041 ] ③TIL中混有CD4+CD25巧reg亞群，其會抑制CTL擴增效率；
[0042] ④由于體外分離擴增時間長，增加了污染的機會。
[0043] (2)TCR基因修飾法
[0044] ①外源性質(zhì)粒(逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒等)的引入，給臨床應(yīng)用帶來一定的風(fēng)險；
[0045] ②內(nèi)源性TCR干擾，導(dǎo)入的TCR基因可能并不能導(dǎo)入預(yù)期的位點，而與內(nèi)源性的TCR 發(fā)生錯排，其能識別抗原不是預(yù)期設(shè)計的，且是未知的，存在很大的風(fēng)險。
[0046] (3)體外人工APC負載抗原致敏法
[0047] ①引入外源物質(zhì):人工APC，制備的CTL是否有人工APC殘留仍是疑問；
[0048] ②人工APC體外致敏CTL的周期較長，需要3-4周，獲得CTL還需要擴增培養(yǎng)后才能 滿足臨床治療的需要，因此體外培養(yǎng)的周期長，污染的幾率較大。
[0049] 目前還沒有文獻報導(dǎo)過制備時間短、擴增倍數(shù)高、CTL純度高且殺傷效果好的HLA- A0201限制性抗原特異性CTL