。每 日觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，適時補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基含10%滅活混合正常人AB血清、200IU/ml rhIL-2的RPMI1640完全培養(yǎng)基，細(xì)胞增殖到一定量擴(kuò)瓶。培養(yǎng)至第10天收獲細(xì)胞。用生理鹽 水洗涂2次和重懸，計算獲得的細(xì)胞數(shù)量。取3X105個左右細(xì)胞，加入抗人CD8、CD45R0、 CD62UCCR7單抗進(jìn)行標(biāo)記CTL，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析CD8+CD45R0+CD62L+CCR7巧的比 例。W及對祀細(xì)胞的殺傷能力。平均獲得CTL細(xì)胞總量為（0.9 ±0.4) X 109，CTLgm比例平均 為:38.5±4.1%，效祀比為30:1時0化殺傷力平均為21.6±4.8%。
[0103] M2為常規(guī)方法二：目標(biāo)CTL第一輪擴(kuò)增和分選純化同本專利方法，目標(biāo)CTL第二輪 擴(kuò)增時，用含10 %滅活混合正常人AB血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為2 X lOVml，接種至75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶30ml，加入1.5 X lOVml抗CD3/28磁珠和終濃度為 500IU/ml的rhIL-2,輕輕混勻置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培育。每日觀察細(xì)胞的生長狀 態(tài)，適時補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基含10%滅活混合正常人AB血清、200IU/ml rhIL-2的RPMI1640完全 培養(yǎng)基，細(xì)胞增殖到一定量擴(kuò)瓶。培養(yǎng)至第10天收獲細(xì)胞。用生理鹽水洗涂2次和重懸，計算 獲得的細(xì)胞數(shù)量。取3X105個左右細(xì)胞，加入抗人CD8、CD45R0、CD6化、CCR7單抗進(jìn)行標(biāo)記 CTL，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析CD8+CD45R0+CD6化+CCR7巧的比例，W及對祀細(xì)胞的殺傷 能力。平均獲得CTL細(xì)胞總量為（1.0±0.3)X109,CTLcm比例平均為:33.1 ±3.6%，效祀比為 30:1時CTL殺傷力平均為24.2 ±4.4%。
[0104] M3為本專利方法，平均獲得CTL細(xì)胞總量為（2.9±0.4)X109, CTLcm比例平均為： 70.4± 5.3%，效祀比為30:1時CTL殺傷力平均為40.1 ± 3.9%。
[010引 5、本發(fā)明制備的目標(biāo)CTL細(xì)胞中CTLcm比例高
[0106] 本發(fā)明制備的CTLs中表達(dá)CD3+CD45R0+CD6化+CCR7+表型的中屯、型記憶CTL比例高 于常規(guī)方法，見附圖4。
[0107] 比較Ξ種擴(kuò)增體系制備的目標(biāo)CTL的擴(kuò)增能力、表型和殺傷力，結(jié)果顯示:本專利 誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)的CTL擴(kuò)增能力最強(qiáng)，細(xì)胞總量可達(dá)（2.9 ± 0.4) X 109，其中CTLgm比例可達(dá) 70.4%，在效祀比為30:1時，對于祀細(xì)胞(負(fù)載化4-42-111(：-1多膚的了2細(xì)胞株）的殺傷能力 平均可達(dá)40.1%。
【附圖說明】
[0108] 圖1:CTL前體細(xì)胞純化前后純度的比較。
[0109] 圖A:單采PBMC流式細(xì)胞檢測圖譜(純化前）
[0110] 方法:分別取50μ1 PBMC(約3X105個細(xì)胞)加入3支流式管內(nèi)，第一管內(nèi)再加入扣1 FITC標(biāo)記的抗人CD4抗體，5μ1陽標(biāo)記的抗人CD8抗體，5μ1 PerCP標(biāo)記的抗人CD3抗體和扣1 APC標(biāo)記的抗人CD56抗體;第二管內(nèi)加入扣1 APC標(biāo)記的抗人CD14抗體;第Ξ管加入扣1 APC 標(biāo)記的抗人CD19抗體，充分混勻，4°C避光解育30分鐘，取出后每管加入1ml預(yù)冷的含2% (V/ V)新生牛血清的生理鹽水洗涂兩遍并重懸后，用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用 Cellquest軟件分析CD3+CD4+T%、CD3+CD8+T%、CD14+%、CD19+%、CD3-CD56+%比例。 [01川結(jié)果：
[0112] CD14+%(M〇):5.08% CD19+% (B) :0.96%
[0113] CD3+CD4+T %：14.84 % CD3+CD8+T %：40.13 %
[0114] CD3-CD56+%(NK ):0.66%
[0115] 圖郎茲珠陰性選擇后CTL前體細(xì)胞流式細(xì)胞檢測圖譜(純化后）
[0116] 方法：單采PBMC用CD4+CD19+CD16/56巧分選磁珠陰性選擇，剔除CD4巧細(xì)胞、NK細(xì) 胞和B細(xì)胞后，收集未結(jié)合磁珠細(xì)胞按照純化前的流式染色方法進(jìn)行染色，分析CD3+CD4+ T%、CD3+CD8+T%、CD14+%、CD19+%、CD3+CD56+%、CD3-CD56+%比例的變化。結(jié)果顯示，經(jīng) 過磁珠陰性選擇后，CD3+CD8+T%比例達(dá)到97.45%，純度提高了二倍。
[0117] 結(jié)果：
[011 引 CD3+CD4+T% :4.73% CD3+CD8+T% :97.45%
[0119] CD14+% (Mo) :0.10% CD19+% (B) :0.48%
[0120] CD3-CD56+%(NK )：0.00%
[0121] 圖2:兩種不同方法誘導(dǎo)的DC表型比較
[0122] 方法:分別取50μ1 riiGM-CSF+rhlFN-a誘導(dǎo)3天的DC(約3X105個細(xì)胞)加入4支流 式管中，第一管加入扣ira標(biāo)記的CD40、5yl PerCP標(biāo)記的化A-DR和扣1 APC標(biāo)記的抗人 CDllc抗體，第二管加入扣1陽標(biāo)記的抗人CD80抗體、5μ1 PerCP標(biāo)記的抗人HLA-DR抗體和5 μ1 APC標(biāo)記的抗人CDllc抗體，第Ξ管加入扣1陽標(biāo)記的抗人CD83抗體、5μ1 PerCP標(biāo)記的 抗人化A-DR抗體和化1 APC標(biāo)記的抗人CD1 Ic抗體，第四管加入扣1 PE標(biāo)記的抗人CD86抗 體、5μ1 PerCP標(biāo)記的抗人HLA-DR抗體和扣1 APC標(biāo)記的抗人CDllc抗體，充分混勻，4°C避光 解育30分鐘，取出后每管加入1ml預(yù)冷的含2% (V/V)新生牛血清的生理鹽水洗涂兩遍并重 懸后，用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用Cel Iquest軟件分析HLA-DR+CD1 lc+%、 CD40+HLA-DR+CD11C+%、CD80+HLA-DR+CDllc+%、CD83+HLA-DR+CDllc+%、CD86+HLA-DR+ CD11C+%比例。riiGM-CSF+rhIL-4誘導(dǎo)7天的DC用同樣方法進(jìn)行檢巧U。結(jié)果顯示，本專利采用 的riiGM-CSF+rhlFN-a誘導(dǎo)3天的DC純度表型化LA-DR+CD1 lc+)為91.93%，成熟度表型（CD83 + )為94.95 % eriiGM-CSF+rh比-4誘導(dǎo)7天的DC純度表型為97.05 %，成熟度表型為95.39 %， 兩者無明顯差異。
[0123] 結(jié)果：
[0124] 圖A: rhGM-CSF+rh IFNa誘導(dǎo)3天DC表型流式檢測圖譜：
[0125] HLA-DR+CD11C+% :91.93% CD40+HLA-DR+CDllc+% :92.68%
[01%] CD80+HLA-DR+CDllc+%:86.82% CD83+HLA-DR+CDllc+%:94.95%
[0127] CD86+HLA-DR+CDllc+% :96.09%
[012引圖B:rhGM-CSF+rh比-4誘導(dǎo)7天DC表型流式檢測圖譜：
[0129] HLA-DR+CD11C+% :97.05% CD40+HLA-DR+CDllc+% :88.33%
[0130] CD80+HLA-DR+CD11C+% :85.41% CD83+HLA-DR+CDllc+% :95.39%
[0131] CD86+HLA-DR+CDllc+% :97.05%
[0132] 圖3目標(biāo)CTL第一輪擴(kuò)增后流式檢測圖譜
[0133] 圖A:目標(biāo)CTL第一輪擴(kuò)增后細(xì)胞流式檢測圖譜(純化前）
[0134] 圖B:目標(biāo)CTL第一輪擴(kuò)增后細(xì)胞流式檢測圖譜(純化后）
[0135] 方法：CTL第一輪擴(kuò)增后用PE標(biāo)記HLA-A2+MUC-1+的Te化amer和FITC標(biāo)記的抗人 CD8抗體對擴(kuò)增的CTL進(jìn)行標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀分選Tetramer+CD8+CTL細(xì)胞，分選前 Tetramer+CD8巧純度為4.48 %，分選后達(dá)到97.51 %。
[0136] 圖4Ξ種不同方法制備的CTL表型的比較
[0137] 圖A(M1):液相鼠抗人CD3單克隆抗體+比-2擴(kuò)增體系制備的CTL表型流式檢測圖譜 [013引圖B(M2):液相CD3/28磁珠，IL-2擴(kuò)增體系制備的CTL表型流式檢測圖譜
[0139] 圖C(M3):固相鼠抗人CD3單克隆抗體，化-2,化-7,化-15,自體PBMC擴(kuò)增體系制備 的CTL表型流式檢測圖譜
[0140] 方法:純化后的目標(biāo)CTL分為3份，第一份加入終濃度50ng/ml鼠抗人CD3單克隆抗 體和500IU/ml化-2進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，第二份加入終濃度10μg/ml CD3/28磁珠和250IU/ml IL-2進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，第Ξ份加入鼠抗人CD3單克隆抗體化g/ml預(yù)包被過夜的培養(yǎng)瓶，按照目 標(biāo)CTL:PBMC= 1: 2的比例加入經(jīng)丫射線福照的PBMC，并加入終濃度500IU/ml的化-2和終濃 度25ng/ml比-15進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)至第7天收獲CTL。取50ylCTL(約3 X 105個細(xì)胞)加入2 管流式管內(nèi)，第一管加入化1 FITC標(biāo)記的抗人CD6化抗體，5μ1ΡΕ標(biāo)記的抗人CCR7抗體，5μ 1APC標(biāo)記的抗人CD45R0抗體，第二管加入扣IPerCP標(biāo)記的抗人CD3抗體和扣1陽標(biāo)記的抗人 CD8抗體，充分混勻，4°C避光解育30分鐘，取出后每管加入1ml預(yù)冷的含2% (V/V)新生牛血 清的生理鹽水洗涂兩遍并重懸后，用FACS化libur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用Cel Iquest軟 件分析CD3+CD扣T %、CD45R0+CD6化+ %和CCR7+CD62L+%比例，獲得CTL的表型流式圖，本專 利方法制備的CTL的CD3+CD8W % 為94.98 %，其中 CD45R0+CD6化+ % 達(dá)到70.02 %，CCR7+ CD62L+%達(dá)到70.28%，明顯高于方法1和2。
[0141] 圖5不同方法制備的CTL殺傷能力的比較mMUC-li7〇-i78CTL為例）。
[0142] 圖A(M1)液相鼠抗人CD3單克隆抗體+比-2擴(kuò)增體系制備的CTL殺傷能力
[0143] 圖B (M2)液相CD3/28磁珠，比-2擴(kuò)增體系制備的CTL殺傷能力
[0144] 圖C(M3)固相鼠抗人CD3單克隆抗體，IL-2，IL-7，IL-15，自體PBMC擴(kuò)增體系制備的 CTL殺傷能力
[0145] 方法：祀細(xì)胞1:為負(fù)載MUC-1170-178多膚的HLA-A化T2細(xì)胞株，祀細(xì)胞2:為HLA-A化 T2空載細(xì)胞株，祀細(xì)胞3:K562(NK敏感細(xì)胞株）。
[0146] 實(shí)施例1制備的CTL分別與上述3種祀細(xì)胞按照效祀比3 :1、10 :1和30 :1的比例混 合，MTT法檢測CTL殺傷活性。結(jié)果顯示，本發(fā)明方法制備的CTL對祀細(xì)胞的特異性殺傷活性 在效祀比為10:1時，達(dá)到24.11 %，明顯高于方法1和2。
[0147] 具體實(shí)施方法
[0148] W下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
[0149] 實(shí)施例1 MUC-117Q-178抗原多膚特異性CTL制備
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