一種小麥抗旱、耐鹽基因TaPIP1A及其編碼蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種小麥抗旱、耐鹽基因化PIP1A 及其編碼蛋白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前全球水資源短缺，在有限的±地資源前提下有效的農(nóng)業(yè)耕種顯得尤為重要。 非生物脅迫對農(nóng)作物的產(chǎn)量影響較大，在各種非生物脅迫中，旱脅迫和鹽脅迫經(jīng)常引起植 物細胞脫水、離子平衡被打破，進而導致農(nóng)作物產(chǎn)量降低，運就要求固定根生植物面對各種 外界逆境脅迫因素，必須具備與脅迫因素相適應(yīng)的應(yīng)激機制W降低脅迫傷害。因此，植物在 各種脅迫下維持其水分平衡的機理一直是抗逆研究的熱點，也是通過基因工程培育耐鹽抗 旱農(nóng)作物新品種的研究基礎(chǔ)。
[0003] 水通道蛋白是一類高效轉(zhuǎn)運水分子的整合膜蛋白，在植物水分轉(zhuǎn)移過程中起著重 要作用。水分在植物體內(nèi)運輸有Ξ種途徑:質(zhì)外體途徑、共質(zhì)體途徑和跨細胞途徑。水分的 跨膜運輸有Ξ種方式:通過脂雙層(胞膜）的自由擴散運輸、通過膜轉(zhuǎn)運蛋白的運輸和通過 水通道蛋白的被動運輸。目前通常將植物水通道蛋白分為四類:位于質(zhì)膜上的質(zhì)膜內(nèi)在蛋 白PIPS、位于液泡膜上的液泡膜內(nèi)在蛋白TIPs、存在于共生根瘤類菌體周圍膜上Nod26類、 小分子堿性膜內(nèi)在蛋白SIPs。目前，人們已對煙草等作物的水通道蛋白做了一些相關(guān)的研 究，但是小麥的水通道蛋白功能及作用機制的研究卻很少。小麥是全球重要的糧食作物之 一，其抗旱或/和耐鹽研究日益受到人們的關(guān)注。因此，研究小麥在干旱和鹽脅迫下其與脅 迫因素相適應(yīng)的應(yīng)激機制的相關(guān)基因，并利用相關(guān)基因的特性培育小麥及其他植物抗旱耐 鹽新品種，對農(nóng)業(yè)發(fā)展具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種小麥抗旱、耐鹽基因化PIP1A及其編碼蛋白和應(yīng)用，為農(nóng) 作物抗旱耐鹽新品種的研究和培育提供候選基因，W培育更多抗旱耐鹽植物新品種。
[0005] 本發(fā)明是運樣實現(xiàn)的：一種小麥抗旱、耐鹽基因化PIP1A，所述基因化PIP1A的cDNA 序列如SEQ ID NO : 1所示;所述基因化PIP1A的曲ΝΑ序列如沈Q ID NO : 2所示，其曲ΝΑ由 3個外顯子和2個內(nèi)含子組成;從5 '端開始，夕F顯子的長度依次為64化Ρ、14化Ρ、96bp，內(nèi)含子 長度依次為129bp、ll化P。
[0006] 本發(fā)明還公開了一種小麥抗旱、耐鹽基因 TaPIPlA的編碼蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 3所示;該基因化PIP1A的編碼蛋白是一種定位于細胞質(zhì)膜的小麥水通道蛋白 質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明還公開了一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含權(quán)利要求1所述的小麥抗旱、耐 鹽基因 TaPIPlA;該質(zhì)粒的載體優(yōu)選為PCAMBIA1300,即重組質(zhì)粒優(yōu)選為PCAMBIA1300- 化PIP1A，此外，任何一種可W將外源基因?qū)胫参镏斜磉_的載體都可W用于本發(fā)明。
[0008] 本發(fā)明提供的小麥抗旱、耐鹽基因化PIP1A在選育抗旱耐鹽植物品種中的應(yīng)用，該 植物優(yōu)選小麥或擬南芥。
[0009] 具體應(yīng)用方法為:將所述小麥抗旱、耐鹽基因化PIP1A或者將含有小麥抗旱、耐鹽 基因 TaPIPlA的重組質(zhì)粒導入宿主小麥或擬南芥的細胞、組織或器官中，培育得到具有抗 旱、耐鹽小麥或擬南芥新品種。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或細胞系進行篩選，可W對含有所述 基因 TaPIPlA的植物表達載體pCAMBIA1300-TaPIPlA進行加工，可W加入選擇標記，如GUS 絕 〇 〇
[0010] 本發(fā)明所用科農(nóng)9204化N9204)為審定品種，于2002年通過河北省農(nóng)作物品種審 定委員會審定;2003年通過全國品種審定，品種審定編號為國審麥2003037。
[0011] 本發(fā)明應(yīng)用了植物基因工程技術(shù)，首次從小麥科農(nóng)9204中獲得基因化PIP1A，通過 實驗證明，該基因化PIP1A通過農(nóng)桿菌介導的方法將該基因轉(zhuǎn)入植物(擬南芥）中，該轉(zhuǎn)基因 能夠使植物(擬南芥)具有較強的抗旱耐鹽能力，運為農(nóng)作物耐鹽抗旱新品種的研究和培育 提供了良好的候選基因，對實現(xiàn)培育抗旱耐鹽植物新品種具有十分重要的意義。
【附圖說明】
[0012] 圖1為小麥基因 TaPIPlA的cDNA序列及曲NA序列的擴增結(jié)果。Μ為DNA Markerlll (天根生化科技有限公司，北京）。
[001引圖2為轉(zhuǎn)基因 TaPIPlA擬南芥陽性植株的分子檢測結(jié)果。
[0014] 圖3為轉(zhuǎn)基因化PIP1A擬南芥在種子萌發(fā)期耐鹽性和耐旱性的表型鑒定結(jié)果。
[0015] 圖4為轉(zhuǎn)基因化PIP1A擬南芥在干旱和鹽脅迫下種子萌發(fā)率統(tǒng)計結(jié)果。
[0016] 圖5為轉(zhuǎn)基因化PIP1A擬南芥在苗期的耐鹽性鑒定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0017] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例中所用的試驗材 料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。W下實施例中的定量試驗，均設(shè)置Ξ次重 復實驗，結(jié)果取平均值。文中的Μ表示mol/L。
[0018] 實施例1小麥化PIP1A基因的克隆 1、提取小麥總RNA (1) 將科農(nóng)9204的組織材料放入液氮預冷的研鉢中，在液氮中充分研磨成粉末； (2) 待液氮揮發(fā)干，立即轉(zhuǎn)移到2ml的離屯、管中，每lOOmg材料約加入1ml的Invitrogen 公司的Trizol提取液，融化后，用加樣槍反復吸吹，劇烈振蕩混勻樣品，使其充分裂解，室溫 放置5分鐘； (3) 加入0.2ml氯仿（chloroform)，劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘；在4°C下， 12000巧m離屯、15分鐘； (4) 小屯、吸出上層水相，加入到干凈的1.5ml的離屯、管中，加入50化1的異丙醇(上層水 相與異丙醇的體積比為1:1)，充分混勻，在-20°C下，沉淀30 min;在4°C下，12000 rpm離屯、 10 min,小屯、棄去上清液，留沉淀； (5) 將沉淀用1 ml的體積百分比濃度為75%的乙醇溶液洗涂，在4°C下，8000 rpm離屯、10 min,收集RNA沉淀； (6) RNA沉淀于無菌操作臺上驚干約10-15分鐘，當RNA略顯透明，加入50 μ1的RNase- 打ee水充分溶解，可放于-80°C下長期保存，備用； (7)用紫外分光光度計及質(zhì)量百分比濃度為1%的Agrose凝膠電泳檢測RNA濃度及質(zhì)量。
[0019] 2、cDNA 反轉(zhuǎn)錄 按照RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒(TaKaRa, DRR019A)的說明書進行;首先進行 第一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，W500 ng的RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，按照所述說明書指示在反應(yīng)體系 中依次加入由MgCl2、10XRT buffe;r、RNase Free 地2〇、dNTP Mixture、RNase InWbitor、 AMV Reverse Transcriptase、01igo dT Primer和Total RNA組成的反應(yīng)體系共 10 化。反 應(yīng)程序為:42°C 30 min,99°C 5 min,5°C 5 min。
[0020] 3、克隆和序列測定 (1似cDNA為模板，在5 ' UTR和3 ' UTR設(shè)計基因特異引物，引物序列分別為： 上游引物Xbal-PIPIA: 5 ' -GCTCTAGATCTCTCCCAAAGCCAAGAGC-3 '，下游引物BamHI- PIP1A:5 '-CGGGATCCCAGCGATAAGATTCCACCCG-3'； (2) PCR反應(yīng)體系(共20化）： 2XTaq PCR MasterMix 10 μL 上游引物Xbal-PIPIA 0.5化 下游引物BamHI-PIPlA 0.5化 模板cDNA 1化 d地2〇 8化 (3) PCR反應(yīng)程序:94°C預變性5 min;94°C變性30 sec，58°C退火30 sec，72°C延伸 1 minl5s，30循環(huán)/min;72°C延伸7 min;2(TC保存，擴增得到的特異擴增條帶如圖1所示； 回收PCR產(chǎn)物連接pEASY-Blunt cloning vector(全式金生物技術(shù)有限公司）進行測 序，擴增得到的PCR產(chǎn)物的核巧酸序列為SEQ ID NO : 1，其起始密碼子到終止密碼子的大 小為879 bp，該PCR產(chǎn)物的基因命名為化PIP1A，該基因化PIP1A的編碼蛋白的氨基酸序列如 沈Q ID NO : 3所示。
[0021 ] 實施例2 TaPIPlA基因組曲NA全長克隆 (1)曲NA提取:按照植物曲NA提取試劑盒說明書(天根生化科技有限公司，北京)方法提 取科農(nóng)9204小麥曲NA; (2 ) W科農(nóng)9204的曲NA為模板，在5 ' UTR和3 ' UTR設(shè)計基因特異引物，上下游引物如下： 上游引物Xbal-PIPIA:5'- GCTCTAGATCTCTCCCAAAGCCAAGAGC -3'， 下游引物BamHI-PIPlA:5'- CGGGATCCCAGCGATAAGATTCCACCCG -3'； 進行PCR擴增，擴增條件同實施例1擴增cDNA的操作步驟。將得到的特異擴增條帶如圖1 所示，連接pEASY-Blunt cloning vector并測序，得到了基因 TaPIPlA在科農(nóng)9204中的全長 曲NA序列，從起始密碼子到終止密碼子大小為1124 bp。
[0022] 由于實施例中cDNA的開放閱讀框大小為879 bp，其曲ΝΑ從起始密碼子到終止密碼 子的大小亦為1124 bp，通過核巧酸序列比對顯示，基因化ΡΙΡ1Α的曲ΝΑ由3個外顯子和2個 內(nèi)含子組成；從5'端開始，夕F顯子的長度依次為642bp、141 bp、96bp，內(nèi)含子長度依次為 129bp、ll化P。
[0023] 實施例3重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-TaPIPlA的獲得 (1)用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamHI對由實施例1得到分子量為879bp的PCR產(chǎn)物（基因 TaPIPlA)進行雙酶切，其雙酶切體系為:Xbal 1μ1，BamHI化1，10 X buf f erK 1μ1，PCR產(chǎn)物化 1，dd出Ο 1化1，得化PIPIA基因的酶切產(chǎn)物； (2) 用內(nèi)切酶Xbal和BamHI對質(zhì)粒PCAMBIA1300雙酶切，其雙酶切體系:Xbal 1μ1，BamHI 1 yiaOXbufferK化1，質(zhì)?；痩，dd出Ο 1化1，獲得PCAMBIA1300的酶切產(chǎn)物； (3) 分別