一種煙草干旱響應(yīng)基因NtRDP1及其編碼蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種煙草干旱響應(yīng)基因化RDP1及其編碼 蛋白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草作為重要的經(jīng)濟作物，在整個生育期對水分的要求很高。隨著全球暖干化，干 旱脅迫普遍存在，且呈加劇趨勢。目前，干旱已成為煙草生長發(fā)育的主要影響因子。干旱出 現(xiàn)在團棵期，易造成煙株早花；出現(xiàn)在旺長期，會造成葉片發(fā)育不良；出現(xiàn)在成熟期，會造成 煙葉厚而粗糖，煙堿、含氮化合物含量過高而含糖量降低，造成糖堿比失調(diào)，還可能造成旱 烘假熟現(xiàn)象。中國大部分煙區(qū)位于干旱、半干旱的丘陵山區(qū)，常因±壤干旱而影響煙株的生 長發(fā)育，導(dǎo)致煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)降低。因此，加強煙草抗旱基因資源的挖掘和利用，對于優(yōu) 質(zhì)煙葉生產(chǎn)具有重要意義。
[0003] 干旱對煙草生長發(fā)育、生理生化及產(chǎn)、質(zhì)量有著重要的影響。干旱對煙草生長發(fā)育 的影響，主要表現(xiàn)在不僅降低了種子的萌發(fā)和幼苗的成活，還抑制了根系的生長，從而影響 了礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收；另外，干旱脅迫還導(dǎo)致植株生長矮小，節(jié)間短，葉片小，易早衰。干旱對 煙草生理生化的影響，主要表現(xiàn)在干旱脅迫影響了葉片葉綠素的合成，促進了葉綠素的分 解，從而降低了葉片的光合效率(Plant Molecular Biology,1979,20: 37-44);干旱脅迫 還導(dǎo)致植株氮素代謝關(guān)鍵酶硝酸還原酶(NR)的活性降低，而蛋白水解酶活性增強引起脯氨 酸、谷氨酷胺、天冬酷胺和鄉(xiāng)氨酸等大量積累；另外，干旱脅迫還導(dǎo)致葉片膜脂過氧化作用 增強，膜透性增加，丙二醒(MDA)含量升高，出現(xiàn)電解質(zhì)外滲?？寡趸Ｗo酶S0D、P0D、CAT等 酶活性顯著下降（作物學(xué)報，1996,22:117-121)。另外，干旱不但影響煙葉產(chǎn)量，而且會造成 煙葉的總氮、煙堿、蛋白質(zhì)含量的增加；總糖、還原糖和鐘含量的減少，導(dǎo)致品質(zhì)下降（煙草 科技，1993,6:30-33)。
[0004] 近年來，隨著基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的作物抗旱基因 被克隆和鑒定。目前作物中克隆的抗旱基因可分為兩大類:第一類為功能基因，主要在植物 抗性中起保護作用。運一類基因主要包括（1)滲透調(diào)芐基因如:海藻糖合成酶基因 TPS1、脯 氨酸合成酶基因 P5CS、甘露醇合成基因 mtlD、甜菜堿合成酶級W內(nèi)BADH、W及多按合成基因 Ode等；（2)保護生物大分子的活性基因如:脫水蛋白基因抓N1、水通道蛋白基因 AQP和晚期 胚胎發(fā)生豐富蛋白LEA等。第二類為調(diào)芐基因，主要在信號傳導(dǎo)和逆境基因表達過程中起調(diào) 節(jié)作用，主要包括一些轉(zhuǎn)錄因子基因如:W服￥、0368、]\1￥8、621?、臟(：等。運些基因在植物基因 工程中已得到廣泛的應(yīng)用。
[000引泛素化是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾方式之一，是蛋白質(zhì)降解的信號。泛 素連接酶是蛋白質(zhì)泛素化過程中的關(guān)鍵酶類，決定了泛素化修飾的特異性。已有研究結(jié)果 表明，泛素連接酶基因在植物抗逆性和激素調(diào)控中起著重要的作用(Plant J，2010, 61: 1029-1040;J Exp Bot，2007，58:221-227)。目前煙草中有關(guān)泛素連接酶編碼基因的克 隆、功能鑒定及應(yīng)用的報道較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種受干旱脅迫誘導(dǎo)表達的煙草基因化RDP1及其應(yīng)用；該基因編碼一 種具有指環(huán)結(jié)構(gòu)的泛素連接酶，過量表達能提高植物對干旱脅迫的適應(yīng)性，尤其能夠提高 植物的抗旱能力。
[0007 ]本發(fā)明具體通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)： 一種煙草干旱響應(yīng)基因化畑P1，來源于煙草(Nicotiana taba州m)，其核巧酸序列為： 1) 序列如SEQ ID N0.1所示的DNA分子;或 2) SEQ ID NO. 1所示核巧酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核巧酸;或 3) 在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白的核巧酸序列。
[000引所述的嚴(yán)格條件為在0.1XSSPE或0.1XSSC和0.1% SDS的溶液中，65°C條件下 雜交并洗膜。
[0009] 本發(fā)明所述煙草干旱響應(yīng)基因化RDP1的編碼蛋白也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0010] 所述的編碼蛋白為如下氨基酸序列之一的蛋白： a) 序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能由序列SEQ ID NO.2衍生的蛋白質(zhì)。
[0011] 上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。
[0012] 本發(fā)明還要求保護上述基因化RDP1的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重 組菌，其中，構(gòu)建所述重組表達載選用的載體為可W引導(dǎo)外源基因在植物中表達的載體。
[0013] 所述重組表達載體具體為將權(quán)利要求1所述基因插入植物表達載體PART27的CaMV 35S啟動子之后的EcoRI和BamHI位點之間得到的重組質(zhì)粒。
[0014] 本發(fā)明還提供了所述基因或含有該基因的重組表達載體在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物 中的應(yīng)用，具體為通過將所述的基因或重組載體導(dǎo)入目的植物中，得到抗旱性高于所述目 的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
[0015] 所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，其中較優(yōu)選為煙草。
[0016] 同時，擴增所述基因的全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明中，干旱處理的煙草幼苗葉片中，所述的泛素連接酶 編碼基因化RDP1被誘導(dǎo)表達。本發(fā)明所述的編碼蛋白是植物泛素化蛋白降解途徑中的關(guān)鍵 酶類，所W調(diào)控該蛋白的表達能夠調(diào)節(jié)植物的抗旱性。因此所述的干旱響應(yīng)的基因化RDP1 在植物抗旱領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，其經(jīng)濟效益潛力巨大。
【附圖說明】
[001引圖1是本發(fā)明化畑P1基因的PCR產(chǎn)物電泳圖； 圖2是煙草幼苗葉片中化RDP1基因響應(yīng)干旱脅迫的表達模式柱狀圖； 圖3是化RDP1基因植物表達載體構(gòu)建示意圖； 圖4是轉(zhuǎn)化RDP1基因的煙草株系表達水平柱狀圖； 圖5是化RDP1基因過量表達的煙草植株對干旱脅迫處理的生長表型照片； 圖6是化畑P1基因過量表達煙草植株對干旱脅迫處理的生理指標(biāo)變化的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，W下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述掲示 的技術(shù)內(nèi)容加 W變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實質(zhì)對W下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0020] 實施例1材料干旱脅迫處理 煙草品種NC89種子經(jīng)0.1% HgCb消毒后，放于鋪3層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在溫度為 24-26°C、濕度為60%、光暗交替周期為12h/l化的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待幼苗長至二葉一屯、 (約14天)時，進行20%陽0 6000溶液脅迫處理實驗。處理的時間分別為0、6、12、24、48小 時;脅迫處理后的煙草幼苗作為實驗組，未做脅迫處理的煙草幼苗作為對照組，用于RDP1的 表達分析。轉(zhuǎn)基因煙草植株的干旱處理，采用人工控制誘水法。待植株長至4片葉（約20天） 時，停止誘水14天，觀察各株系生長情況。
[0021 ]實施例2 化畑P1 (RING Domain-con化ining Protein 1)基因的克隆 1)煙草葉片第一鏈cDNA合成 煙草葉片總RNA的分離和純化參照TRIZ化試劑盒（Invitrogen，USA)說明書進行。將所 述的煙草葉片總RNA吸取1-2 yg于1.5 ml離屯、管中，按照Fermentas公司的Reve;rtAid? First Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說明進行反轉(zhuǎn)錄，得到煙草葉片第一鏈cDNA。
[0022] 2)化畑P1基因的PCR擴增 W所述的第一鏈cDNA為模板，進行化RDP1基因的PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。根據(jù)網(wǎng)站 ht1:p:// www.ncbi.nlm.nih.gov/中煙草表達序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tag, EST)信 息設(shè)計煙草的化畑PI基因的全長cDNA引物： 上游引物：5' -ATGAAACAGGATATGGCCTTAG-3'; 下游引物:5' -TCAGAACAAG ATTAAACATG-3'。
[0023] 將所述的PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠照相系統(tǒng)檢測擴增產(chǎn)物(如圖1 所示），獲得741 bp長的片段。
[0024] 電泳結(jié)束后，用生工生物工程上海公司的膠回收試劑盒，按照產(chǎn)品說明回收純化 所述的PCR擴增產(chǎn)物，并送至北京華大基因公司測序，驗證其正確性。
[00巧]實施例3化畑P1基因的表達分析 1)本實例中利用巧光定量RT-PCR方法來分析化畑P1基因在20%陽G 6000脅迫下的表 達情況。實驗樣品為實施例1中所述的實驗者和對照組中的煙草葉片。每個樣品中，按照實 施例2中所述的方法，取5 yg的總RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA作為模板。
[0026] 根據(jù)化RDP1基因全長cDNA序列設(shè)計巧光定量PCR特異引物為： 上游引物：5 ' - CAATGGAGGTCTGATGGACTATGCG-3 ' ； 下游引物：5 ' -TTGCGACACTGACAGGCTGGTTT-3 '。
[0027] 應(yīng)用BioRad iQ5實時定量PCR儀進行PCR擴增，擴增