一種從人外周血記憶性b淋巴細胞制備抗體的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗體的制備方法，具體涉及一種從人外周血記憶性B淋巴細胞制 備抗體的方法。
【背景技術】
[0002] 抗原特異性的單克隆或多克隆免疫球蛋白制劑在預防感染和治療免疫缺陷病中 非常重要(Nat Rev Immunol ,2010,10(5) :301-316)。目前，臨床上應用的免疫球蛋白制劑 基本都分離自志愿者血漿(BioDrugs，2010，24(4): 211-223)。其來源受限，不同批次或來源 的質量不同，且存在潛在的感染因素 (Adv Clin Exp Med,2015,24(1): 153-159)。此外，也 可通過基因工程技術制備，目前治療性抗體有人鼠嵌合體、人源化抗體和全人抗體等，存在 抗原性以及制備成本高、周期長等不足之處(MAbs，2015，7( 1): 9-14)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的不足之處而提供了一種從人外周血記憶 性B淋巴細胞制備抗體的方法。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術方案:一種從人外周血記憶性B淋巴細胞制備抗體 的方法，所述方法包括以下步驟：
[0005] (1)將外周血記憶性B淋巴細胞懸于含體積濃度為10%~20%牛血清的細胞培養(yǎng) 液中，在37°C、5% (V/V)的二氧化碳條件下培養(yǎng)；
[0006] (2)在步驟（1)培養(yǎng)后的細胞培養(yǎng)液中加入活化劑，繼續(xù)培養(yǎng)3-10天，使外周血記 憶性B淋巴細胞分化為漿細胞；
[0007] (3)將步驟(2)制備的漿細胞和在37 °C、5 % (V/V)的二氧化碳條件下復蘇的人骨髓 瘤細胞株融合，制備成雜交瘤細胞株，篩選可分泌抗原特異性的抗體的雜交瘤細胞株，通過 篩選的雜交瘤細胞株分泌抗原特異性的抗體。
[0008] 在前期研究中，本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)活化劑組合(R848+IL-2+IL-4)，可顯著活化記 憶性B細胞，使之高效的轉換為漿細胞，進而分泌大量的抗原特異性的抗體。再用人骨髓瘤 細胞株與漿細胞融合制備成雜交瘤細胞株，可持續(xù)分泌大量抗體，再用特異的抗原進行篩 選，從而獲得大量的抗原特異性的多克隆或單克隆抗體。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中細胞培養(yǎng)液為DMEM、RPMI1640和DMEM/F12培養(yǎng)基中的一 種。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中活化劑包括以下濃度的組分：0.1~30μg/ml R848、1~ 200ng/ml IL-2和10~200ng/ml IL-4。
[0011]優(yōu)選地，所述步驟(3)中人骨髓瘤細胞株是對HAT (次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)敏 感、對喹巴因和聚乙二醇耐受且不分泌抗體的人骨髓瘤細胞株。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中融合所用的融合劑是濃度為30%-70% (W/V)的聚乙二醇， 所述聚乙二醇的分子量為1000-4000。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中抗原是接種免疫的抗原、天然感染的病原體或自身抗原。
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中復蘇所用的培養(yǎng)基是含10%~20%(V/V)牛血清的細胞培 養(yǎng)液。
[0015] 優(yōu)選地，所述細胞培養(yǎng)液是DMEM、RPMI 1640和DMEM/F12培養(yǎng)基中的一種。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中人骨髓瘤細胞株與漿細胞的數(shù)量比為1:10。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種從人外周血記憶性B淋巴細胞制備抗 體的方法，本發(fā)明提供的方法方便快捷、低成本，采用該方法能在體外制備大量抗體的，所 制備抗體在預防感染和治療免疫缺陷病中非常重要。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明實施例1中復蘇的人骨髓瘤細胞株生長圖片；
[0019]圖2為本發(fā)明實施例1中得到的雜交瘤細胞生長圖片；
[0020] 圖3為本發(fā)明實施例1中ELISA檢測雜交瘤分泌抗輪狀病毒抗體的結果(實施例1中 的表1是以0D.450吸光值表示圖3的數(shù)字結果）。
【具體實施方式】
[0021] 為更好的說明本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，下面將結合具體實施例對本發(fā)明 作進一步說明。
[0022] 實施例1:制備抗輪狀病毒抗體
[0023] (1)用商品化試劑盒(Human Memory B Cell Isolation Kit,Miltenyi Biotec)， 從接種輪狀病毒的志愿者外周血分離記憶性B淋巴細胞，于含10%牛血清的RPMI1640培養(yǎng) 液中，于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0024] (2)向步驟（1)的培養(yǎng)液中加入活化劑，繼續(xù)培養(yǎng)5天，使記憶性B淋巴細胞分化為 漿細胞;所述活化劑組成為：l〇μg/ml R848、20ng/ml IL-2和 10ng/ml IL-4;
[0025] (3)復蘇培養(yǎng)人骨髓瘤細胞株，于含10 %牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37°C、5 % (V/V)二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如圖1所示；
[0026] (4)將步驟(2)制備的漿細胞和步驟(3)復蘇的人骨髓瘤細胞株融合，制備成雜交 瘤細胞株，篩選可分泌抗輪狀病毒抗體的雜交瘤細胞株，從而制備大量抗輪狀病毒抗體。 [0027]步驟(4)的具體步驟如下：
[0028]①取生長狀態(tài)良好的步驟(3)復蘇的人骨髓瘤細胞株，SOOrpm離心8分鐘，棄上清， 計數(shù)；
[0029] ②取生長狀態(tài)良好的步驟(2)制備的漿細胞，800rpm離心8分鐘，棄上清，計數(shù)；
[0030] ③將①中人骨髓瘤細胞株與②中漿細胞按數(shù)量比為1:10的比例混合，在50ml塑料 離心管內(nèi)用無血清的DMEM細胞培養(yǎng)液液洗1次，800rpm離心8分鐘，棄上清，用滴管吸凈殘留 液體；
[0031 ]④輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動；
[0032] ⑤60秒內(nèi)加入預熱的1ml 50% (W/V)PEG(分子量:4000)，沿著瓶壁逐漸滴加，邊加 邊轉動離心管;靜置作用100秒；
[0033]⑥加預熱37°C的不含血清的RPMI1640,終止PEG的作用，每隔1分鐘分別加入lml， 2ml，3ml，4ml，5ml和 10ml。終體積為45ml JOOrpm離心8分鐘；
[0034]⑦棄上清，先用6ml含10%(V/V)牛血清、已加入1:100濃度的HAT(100X )的 RPMI1640細胞培養(yǎng)液輕輕混懸，不能用力吹打，防止