一種海洋真菌哈茨木霉dlen2008005的發(fā)酵提取物及其制備方法和應用
【專利說明】一種海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵提取物及其制備方法和應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物技術領域。更具體地，涉及一種海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵提取物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]隨著世界人口老齡化的加劇和老年癡呆(Alzheimer’s Disease, AD)發(fā)病率的不斷增加，尋找抗老年癡呆的新藥已迫在眉睫。
[0003]目前，被廣泛接受的老年癡呆病理理論是膽堿能神經損傷假說。在該理論的指導下，乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)抑制劑是目前應用最廣的抗老年癡呆癥藥物。同時不少研究發(fā)現，需氧細胞代謝過程中產生的超氧自由基會對腦組織造成損害，促進腦細胞的衰老和死亡，而且自由基還能損害細胞染色體，使第21號染色體畸變，從而發(fā)生AD。而抗氧化劑不僅能夠穩(wěn)定細胞膜，消除活性氧，同時還能抑制和清除腦內β淀粉樣蛋白沉積，從而來預防和保護神經細胞免受損傷，從而延緩AD的發(fā)展進程。
[0004]因為乙酰膽堿酯酶抑制劑和抗氧化劑均有治療或延緩AD的作用，因此篩選具有抑制AChE活性和抗氧化雙重功能的藥物具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是克服現有老年癡呆治療藥物的不足，提供一種海洋真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)DLEN2008005的發(fā)酵液活性提取物及其制備方法和應用，該菌株發(fā)酵液的活性提取物具有很好的抗氧化和抑制乙酰膽堿酯酶活性，在制備抗老年癡呆藥物方面具有很好的應用前景。
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵提取物。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供上述發(fā)酵提取物及其制備方法和應用。
[0008]本發(fā)明的再一目的是提供海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵活性物質及其提取純化方法和應用。
[0009]本發(fā)明上述目的通過以下技術方案實現:
一種海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵提取物，是由海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵液經過提取得到，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005于2016年I月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(其簡稱為CGMCC)，保藏編號為:CGMCC N0.12105;保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0010]該菌株通過靜置發(fā)酵后，將其發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物與菌絲體甲醇提取物合并得到具有抗氧化和抑制乙酰膽堿酯酶活性的總粗提物，該提取物經硅膠柱層析及制備液相色譜分離，得到兩個有效部分的組分I和組分2，具有抗氧化和抑制乙酰膽堿酯酶的顯著活性，有作為抗老年癡呆藥物的潛在用途。
[0011 ] 所述海洋真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)DLEN2008005是從中國大連海域的潮間帶海藻龍須菜藻體組織內分離獲得，具有抗氧化和抑制乙酰膽堿酯酶作用，依據《真菌鑒定手冊》(魏景超，1979)鑒定為Trichoderma harzianum菌株。
[0012]該菌株的ITS1-5.8S-1TS2rDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]該菌株具有下述性質:接種到海水馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(海水PSA)平板上，28°(:培養(yǎng)，菌落開始為白絮狀，圓形，向四周擴展，后從菌落中央向邊緣產生灰綠色孢子，菌落邊緣顏色略淺，整個菌落呈松散絮狀;顯微鏡下菌絲纖細無色，具分隔，多分枝;分生孢子梗從菌絲的側枝上生出，對生或互生，一般有2?3次分枝，著生分生孢子的小梗瓶形或錐形；分生孢子多為球形，孢壁具小統(tǒng)突，藍綠色；最佳生長溫度范圍26?30 0C，最佳生長pH為6.0?7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源;該菌株在海水馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵可產生抗氧化和乙酰膽堿酯酶抑制劑活性物質。
[0014]該菌株的生長鹽濃度范圍為2.0%?5.0%。
[0015]另外，在上述制備發(fā)酵提取物的工藝中，具體地，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵液的獲得方法如下:將海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005接種于滅菌的液體培養(yǎng)基中，自然光照28 °C培養(yǎng)21?24天；
其中，所述液體培養(yǎng)基的制備方法為:每500mL馬鈴薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海鹽，自然PH值;所述馬鈴薯煮汁為:取新鮮馬鈴薯去皮切成Icm3大小塊狀，每200g馬鈴薯塊加蒸餾水500mL煮沸20min，雙層脫脂紗布過濾，并以蒸餾水定容至500mL。
[0016]更具體優(yōu)選地，上述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵液的獲得方法如下:
(1)種子培養(yǎng):將菌種從斜面上接種到無菌的種子固體培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)皿平板置于恒溫培養(yǎng)箱中28 0C下倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為4?5天；
(2)擴大培養(yǎng):將IL液體培養(yǎng)基灌裝到3L三角瓶中，用透氣封口膜封口后于高壓滅菌鍋中121°C、0.1 Mpa滅菌20min;冷卻后按照每100mL液體培養(yǎng)基接種上述步驟(I)培養(yǎng)后的種子平板帶菌培養(yǎng)基塊40?SOcm2的比例接種，封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，自然光照，培養(yǎng)時間為21?24天，得到發(fā)酵液；
其中，所用到的培養(yǎng)基如下:
種子固體培養(yǎng)基為:每500mL馬鈴薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海鹽和15.0g瓊脂，自然pH值；
液體培養(yǎng)基為:每500mL馬鈴薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海鹽，自然pH值；
其中，馬鈴薯煮汁:取新鮮馬鈴薯去皮切成Icm3大小塊狀，每200g馬鈴薯塊加蒸餾水500 mL煮沸20 min，雙層脫脂紗布過濾，并以蒸餾水定容至500mL。
[0017]另外，在上述制備發(fā)酵提取物的工藝中，所述提取的方法如下:
(I)提取:培養(yǎng)結束后得到的發(fā)酵液，用500mL乙酸乙酯過夜殺菌，然后超聲處理30min，加入硅藻土抽濾，濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物;濾餅用200mL甲醇浸泡12?24h后，超聲30min，抽濾，得到甲醇提取物;如此重復2次；
將乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分別用旋轉蒸發(fā)儀于45°C減壓濃縮，最后合并提取物并離心后，繼續(xù)用旋轉蒸發(fā)儀于45°C減壓蒸干，得到一份干固體，為總活性粗提物，即得到所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵提取物。
[0018]上述發(fā)酵提取物在制備抗老年癡呆藥物方面的應用，以及在制備抗氧化藥物和/或抑制乙酰膽堿酯酶活性的藥物方面的應用，都在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0019]一種海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵活性物質(組分1)，是由上述發(fā)酵提取物再經過提純所得，所述提純的方法為:將發(fā)酵提取物溶于少量(優(yōu)選5?20mL)甲醇，加入到與其干重相等的100?200目硅膠，混合并研磨均勻至干燥，上樣于20?50倍樣品干重的200?300目硅膠層析柱上，用洗脫劑逐步梯度洗脫，所用洗脫劑為氯仿:丙酮=25:1?O:1(v/v)，采用薄層色譜生物活性自顯影法追蹤活性組分;將有活性組分的組份樣品采用反相液相色譜的方法進行進一步純化得到;反相液相色譜的條件為:色譜柱SinoChrom ODS-AP，粒徑15μηι，尺寸為20.0 mmX250 mm，流動相為甲醇:水=8:2，流速為2 mL/min，峰的保留時間在4?9 min。
[0020]一種海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵活性物質(組分2)，是由上述發(fā)酵提取物再經過提純所得，所述提純的方法為:將發(fā)酵提取物溶于少量(優(yōu)選5?20mL)甲醇，加入到與其干重相等的100?200目硅膠，混合并研磨均勻至干燥，上樣于20?50倍樣品干重的200?300目硅膠層析柱上，用洗脫劑逐步梯度洗脫，所用洗脫劑為氯仿:丙酮=25:1?O:1(v/v)，采用薄層色譜生物活性自顯影法追蹤活性組分;將有活性組分的組份樣品采用正相液相色譜的方法進行進一步純化得到;正相液相色譜的條件為:SepaFlash ?標準型快速分離娃膠柱-12 g，粒徑40?63 μπι，尺寸為17 mmX85 mm，氯仿:甲醇=5:1，流速為4 mL/min,峰的保留時間在10?15 min。
[0021]而且，上述發(fā)酵活性物質(組分I和組分2)在制備抗老年癡呆藥物方面的應用，以及在制備抗氧化藥物和/或抑制乙酰膽堿酯酶活性的藥物方面的應用，也都在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0022]本發(fā)明經