045](2)鑒定到一株屬于木霉屬的菌株，進(jìn)一步對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定:
將菌株接種到海水PSA平板上28°C下培養(yǎng)7天后，用無菌刀片刮下菌絲，轉(zhuǎn)移進(jìn)無菌的研缽中，加入液氮研磨，然后使用北京Tiangen生物技術(shù)公司的植物基因組提取試劑盒DP305根據(jù)說明書步驟提取DNA，所得DNA樣本溶解于50yL TE緩沖液中。
[0046]以該DNA樣本為模板，使用真菌通用引物ITSl (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)通過PCR反應(yīng)擴增其核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列ITS1-5.8S-1TS2，PCR反應(yīng)條件為:1)起始94°C變性5 min;2)94°C變性0.5 min;3)55°C退火
0.5 min;4)72°C延伸I min;5)最終72°C延伸5 min。其中，步驟2)至步驟4)循環(huán)30次。
[0047]PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用瓊脂糖電泳純化，純化產(chǎn)物用基因測序儀直接測序，測序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對，根據(jù)序列相似性，將該菌株鑒定為哈茨木霉。
[0048]3、經(jīng)過上述分離鑒定，結(jié)果顯示，篩選得到一株海洋真菌哈茨木霉，具有很好的抗氧化和抑制乙酰膽堿酯酶活性。
[0049]該菌株接種到海水馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(海水PSA)平板上，28°C培養(yǎng)，菌落開始為白絮狀，圓形，向四周擴展，后從菌落中央向邊緣產(chǎn)生灰綠色孢子，菌落邊緣顏色略淺，整個菌落呈松散絮狀。
[0050]顯微鏡下，菌絲纖細(xì)無色，具分隔，多分枝。分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，對生或互生，一般有2?3次分枝，著生分生孢子的小梗瓶形或錐形。分生孢子多為球形，孢壁具小疣突，藍(lán)綠色。最佳生長溫度范圍26?30°C，最佳生長pH為6.0?7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源。
[0051 ]該菌株在海水馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵可產(chǎn)生抗氧化和抑制乙酰膽堿酯酶活性的物質(zhì)。
[0052]將該菌株命名為海洋真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)DLEN2008005，并已于2016年I月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(其簡稱為CGMCC)，保藏編號為:CGMCC N0.12105;保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
[0053]實施例2海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005發(fā)酵液活性測試
1、哈茨木霉DLEN2008005發(fā)酵液獲得
(1)種子培養(yǎng):將菌種從斜面上接種到無菌的種子固體培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)皿平板置于恒溫培養(yǎng)箱中28 0C下倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為4?5天；
(2)擴大培養(yǎng):將IL液體培養(yǎng)基灌裝到3L三角瓶中，用透氣封口膜封口后于高壓滅菌鍋中121°C、0.1 Mpa滅菌20min;冷卻后按照每100mL液體培養(yǎng)基接種上述步驟(I)培養(yǎng)后的種子平板帶菌培養(yǎng)基塊40?SOcm2的比例接種，封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，自然光照，培養(yǎng)時間為21?24天，得到發(fā)酵液。
[0054]其中，所用到的培養(yǎng)基:
種子固體培養(yǎng)基為:蔗糖20.0g，馬鈴薯煮汁500mL，海鹽20.0g，瓊脂15.0g，自然pH值。
[0055]液體培養(yǎng)基為:蔗糖20.0g，馬鈴薯煮汁500mL，海鹽20.0g，自然pH值。
[0056]其中，馬鈴薯煮汁:取新鮮馬鈴薯去皮切成Icm3大小塊狀，每200g馬鈴薯塊加蒸餾水500 mL煮沸20 min，雙層脫脂紗布過濾，并以蒸餾水定容至500mL。
[0057]2、經(jīng)過測試，海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的發(fā)酵液具有抗氧化和抑制乙酰膽堿酯酶活性。
[0058]實施例3海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005發(fā)酵液活性物質(zhì)的提取
1、培養(yǎng)基(I)種子固體培養(yǎng)基為:蔗糖20.0g，馬鈴薯煮汁500mL，海鹽20.0g，瓊脂15.0g，自然pH值。
[0059](2)液體培養(yǎng)基為:鹿糖20.0g，馬鈴薯煮汁500mL，海鹽20.0g，自然pH值。
[0060]其中，馬鈴薯煮汁:取新鮮馬鈴薯去皮切成Icm3大小塊狀，每200g馬鈴薯塊加蒸餾水500 mL煮沸20 min，雙層脫脂紗布過濾，并以蒸餾水定容至500mL。
[0061]2、提取方法
(1)種子培養(yǎng):將菌種從斜面上接種到無菌的種子固體培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)皿平板置于恒溫培養(yǎng)箱中28 0C下倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為4?5天；
(2)擴大培養(yǎng):將IL液體培養(yǎng)基灌裝到3L三角瓶中，用透氣封口膜封口后于高壓滅菌鍋中121°C、0.1 Mpa滅菌20min;冷卻后按照每100mL液體培養(yǎng)基接種上述步驟(I)培養(yǎng)后的種子平板帶菌培養(yǎng)基塊40?SOcm2的比例接種，封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，自然光照，培養(yǎng)時間為20?25天，得到發(fā)酵液；
(3)提取:步驟(2)得到的發(fā)酵液用500mL乙酸乙酯過夜殺菌，然后超聲處理30min，加入硅藻土抽濾，濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物;濾餅用200mL甲醇浸泡12-24 h后，超聲30min，抽濾，得到甲醇提取物;如此重復(fù)2次；
將乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45°C減壓濃縮，最后合并提取物并離心后，繼續(xù)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45°C減壓蒸干，得到一份干固體，為總活性粗提物；
(4)提純:將上述總活性粗提物溶于5?20mL甲醇，加入到與其干重相等的100?200目硅膠，混合并研磨均勻至干燥，上樣于20?50倍樣品干重的200?300目硅膠層析柱上，用洗脫劑逐步梯度洗脫，所用洗脫劑為氯仿:丙酮=25:1?O:1 (v/v)，采用薄層色譜生物活性自顯影法追蹤活性組分;將有活性組分的組份樣品采用液相制備的方法進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到白色粉末組分I和2。
[0062]其中，液相制備使用正相柱與反相柱，檢測254nm下紫外吸收，正相柱使用流動相為氯仿-甲醇，反相柱使用流動相為甲醇-水。
[0063]組分I通過反相液相色譜制備得到(條件:色譜柱SinoChrom 0DS-AP，粒徑15μηι，尺寸為20.0 mmX 250 mm，流動相為甲醇:水=8: 2，流速為2 mL/min)，峰的保留時間在4?9
mino
[0064]組分2通過正相液相色譜制備得到(條件:SepaFlash?標(biāo)準(zhǔn)型快速分離硅膠柱-12g，粒徑40?63μηι，尺寸為17mmX85mm，氯仿:甲醇=5:1，流速為4 mL/min)，峰的保留時間在10?15min。
[0065]3、薄層分析顯示:層析展開劑為二氯甲烷:甲醇=5:1時，組分I在GF254薄層硅膠板上Rf值為0.85，254nm紫外燈下具藍(lán)紫色吸收，茴香醛硫酸顯色為棕紅色；組分2在GF254薄層娃膠板上Rf值為0.42，254 nm紫外燈下吸收較弱，茴香醛硫酸顯色為淺灰色。
[0066]4、另外，對這兩個組分進(jìn)行了 HPLC分析，液相型號為Agilent 1260，色譜分析條件如下:色譜柱為Luna 5u C18(2) 100A，尺寸為150 mmX4.6 mm，粒徑5 μπι，系統(tǒng)為甲醇-水，O?15min 15?100%甲醇線性洗脫，15.01?30min 100%甲醇等度洗脫，流速I ml/min。
[0067]5、結(jié)果表明:組分I含有的抗氧化與抑制乙酰膽堿酯酶活性特征成分的主要色譜峰保留時間為19.7?21.4 min;組分2具有抑制乙酰膽堿酯酶活性特征成分的主要色譜峰保留時間11.9?12.6 min。
[0068]實施例4海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005發(fā)酵液活性物質(zhì)的活性測定
1、薄層色譜生物活性自顯影實驗:
(I)取兩塊相同的GF254硅膠板，用干凈的甲醇將其預(yù)展干凈后晾干，分別用毛細(xì)管取11IL組分I和組分2各點樣于層析板上，用二氯甲烷:甲醇=25:1展開。
[0069]抗乙酰膽堿酯酶活性實驗是均勻噴上0.5U/mL AChE，晾干，使酶液固定，然后在370C的恒溫培養(yǎng)箱中保濕孵育20min，孵育結(jié)束后，將DTNB與ATCh以I: I混合，噴霧到板子上，再37°C孵育lOmin，觀察實驗現(xiàn)象。
[0070]抗氧化實驗是在薄層板上噴1.28mmol/L的DPPH甲醇溶液，暗處放置5?8min后，觀察實驗現(xiàn)象。
[0071](2)實驗結(jié)果
薄層色譜生物活性自顯影顯示組分I具有抗氧化與抑制乙酰膽堿酯酶雙重活性，組分2具有抑制乙酰膽堿酯酶活性。