一種人血小板同種抗原系統(tǒng)基因分型的pcr-sbt方法及試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因分型檢測方法,尤其涉及一種用于人血小板同種抗原系統(tǒng)(Human PlateletAlloantigen,縮寫為HPA)的抗原基因分型的分子生物學(xué)檢測方法及該方法所用 的試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 血小板表面存在復(fù)雜的血型抗原,它不僅存在與紅細(xì)胞共有的AB0、H、Lewis等 糖鏈類抗原和與白細(xì)胞共有的HLA-I類抗原,還存在血小板自身特異性的同種抗原系統(tǒng) 化umanplateletalloantigen,HPA),人群中HPA系統(tǒng)表現(xiàn)出高度的遺傳多態(tài)性。個體間 HPA抗原的不同可通過免疫刺激而產(chǎn)生抗體,抗體能與供者相對應(yīng)抗原相結(jié)合從而破壞血 小板,導(dǎo)致血小板輸注無效和其他相關(guān)性疾病,因此研究血小板同種抗原系統(tǒng)具有重要的 意義,有助于疾病診治和解決血小板輸注問題。研究顯示HPA基因定位于血小板糖膜蛋白 和CD109基因上,目前共發(fā)現(xiàn)有28個抗原系統(tǒng)。
[0003] 血小板同種抗原的差異可導(dǎo)致個體受免疫刺激產(chǎn)生抗體,已發(fā)現(xiàn)其抗體與多種疾 病有關(guān),包括新生兒同種免疫性血小板減少癥、血小板輸注無效和輸血后紫薇等。其中血小 板輸注無效在臨床輸血治療中常見,也是目前血小板輸注中需要研究解決的熱點問題。國 內(nèi)外已建立一些方法解決血小板輸注無效,近年來國內(nèi)開始建立獻血者血小板同種抗原基 因數(shù)據(jù)庫,擬提供與患者血小板抗原系統(tǒng)基因型相合的獻血者,W解決血小板輸注無效問 題。
[0004]目前HPA抗原基因分型最主要的方法是多聚酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物 (PCR-SSP),該方法針對同一抗原系統(tǒng)需要設(shè)計兩對引物進行擴增才能有效區(qū)分,因此對檢 測HPA的多個系統(tǒng)需要擴增的孔位較多,此外PCR-SSP方法在設(shè)計引物時只能針對某些具 有區(qū)別性的特異性位點進行設(shè)計,因此對于一些特殊的新突變位點難W明確。而HPA系統(tǒng) 的PCR-SBT (PCR-Sequence based typing,基于PCR測序的分型技術(shù))分型方法可W克服 上述局限性和不足,為目前最準(zhǔn)確的分型的方法。但現(xiàn)階段的HPA抗原基因PCR-SBT分型 方法還不夠完善,雖然也有實驗室采用PCR-SBT的方法對HPA抗原進行基因分型,但至今未 對HPA1-28W系統(tǒng)進行系統(tǒng)分型。因此,建立HPA1-28W系統(tǒng)的PCR-SBT分型方法具有重要 的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明首先要解決的技術(shù)問題是提供一種人血小板同種抗原系統(tǒng)基因分型的 PCR-SBT方法,W克服現(xiàn)有分型技術(shù)中的上述不足之處。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是;一種人血小板同種抗原系統(tǒng)基因 分型的PCR-SBT方法,對HPA抗原系統(tǒng)的基因進行分型,并包括W下步驟: (1)制備人基因組DNA; (2) 提供擴增引物,用聚合酶鏈反應(yīng)分別擴增人基因組DM中抗原系統(tǒng)的基因序列; (3) 將步驟(2)得到的擴增產(chǎn)物進行雙酶切純化; (4) 提供測序引物,將步驟(3)得到的純化產(chǎn)物進行測序PCR反應(yīng); (5) 將步驟(4)得到的測序產(chǎn)物進行醋酸鋼-己醇沉淀法純化,進行毛細(xì)管電泳測序; (6) 將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析,確定其基因型。
[0007] 進一步地,所述HPA抗原系統(tǒng)為HPA1-28W抗原系統(tǒng),所述的HPA1-28W抗原系統(tǒng) 的基因為;HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6W、HPA-7W、HPA-8W、HPA-9W、HPA-lOw、HPA-IIw、HPA-12w、HPA-13w、HPA-Hw、HPA-15、HPA-16W、HPA-17W、HPA-18W、HPA-19W、 HPA-20W、HPA-21W、HPA-22bw、HPA-23bw、HPA-24bw、HPA-2化w、HPA-26bw、HPA-27bw、 HPA-28bw〇
[000引進一步地,所述步驟(2)中的擴增引物為:
[0009] 所述步驟(4)中的測序引物為6條寡核巧酸測序引物,其序列如下:
[0010] 所述步驟(3)中純化所需的兩種酶為奸堿性磯酸酶和核酸外切酶I。
[0011] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種人血小板同種抗原系統(tǒng)基因分型 的PCR-SBT方法所用的試劑,所述抗原系統(tǒng)為HPA1-28W抗原系統(tǒng),由28個抗原基因組成: HPA-I、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6W、HPA-7W、HPA-8W、HPA-9W、HPA-lOw、HPA-IIw' HPA-12W、HPA-13W、HPA-14W、HPA-15、HPA-16W、HPA-17W、HPA-18W、HPA-19W、HPA-20W、 HPA-21W、HPA-22bw、HPA-23bw、HPA-24bw、HPA-2化W、HPA-2化W、HPA-2化W、HPA-28bw,所述 試劑由用于擴增28個HPA抗原基因的18個擴增引物和用于測序分析的6個寡核巧酸測序 引物組成; 所述用于擴增的引物為:
[0012] 本發(fā)明中引物的設(shè)計是PCR擴增的關(guān)鍵,有關(guān)引物設(shè)計的方法和軟件均可從英特 網(wǎng)上免費獲得。本發(fā)明所設(shè)計的寡核巧酸引物是根據(jù)GenBank中人類HPA抗原基因序列 中包括多態(tài)性位點在內(nèi)的連續(xù)寡核巧酸序列而設(shè)計獲得的。HPA-(IUOw)、(4、16w、19w)、 (6w、7w)、(8w、llw、2化w、23bw)、(14w、2化W)、17w抗原系統(tǒng)的;[TGB3基因序列的擴增引物根 據(jù)GenBank中編號為NC_000017. 10 (45331208. . 45390077)的序列設(shè)計;HPA-2 抗原系統(tǒng) 的GPlBA基因序列的擴增引物根據(jù)GenBank中編號為NC_000017. 10 (4835312-4838325) 的序列設(shè)計;HPA- (3、9w、27bw)、20w、22bw、24bw、28bw抗原系統(tǒng)的口GA2B基因序列的擴 增引物根據(jù)GenBank中編號為NC_000017. 10 (42449550-42466873)的序列設(shè)計;HPA-5、 13w、18w、25bw抗原系統(tǒng)的口GA2基因序列的擴增引物根據(jù)GenBank中編號為NC_000005. 9 (52285156-52390609)的序列設(shè)計;HPA-12W抗原系統(tǒng)的GPlBB基因序列的擴增引物根據(jù) GenBank中編號為NC_000022. 10 (19711066-19712297)的序列設(shè)計;HPA-15 抗原系統(tǒng)的 CD109基因序列的擴增引物根據(jù)GenBank中編號為NC_000006. 11 (74405508-74538041) 的序列設(shè)計。正向擴增引物5'端依據(jù)后續(xù)組合情況分別連接有M13載體正向序列 上的18個堿基序列TGTAAAACGACGGCCAGT、PCMVF-BD正向序列上的20個堿基序列 TCTAAAAgCTgCggAATTgT、PDC316正向序列上的18個堿基序列AC^gggTATAAg AggCg,反向 擴增引物5'端連接有M13載體反向序列上的18個堿基序列CAGGAAACAGCTATGACC,PCMV反 向序列上的20個堿基序列TCCAAA CTCATCAATgTATC, pDC316反向序列上的18個堿基序列 CgATgCTAgACgATCCAg。(接頭引物可W互換,但同一組內(nèi)應(yīng)不同) 本發(fā)明W18對寡核巧酸引物分別擴增HPA1-28W系統(tǒng)的18個基因片段。其中HPA-(1、lOw)、(4、16w、19w)、巧w、7w)、(8w、llw、2化w、23bw)、(14w、26bw)、17w抗原系統(tǒng)的引物分 別擴增GenBank編號為NC_000017. 10 (45331208-45390077)序列中 38146-38581 位、 39382-39881 位、46946-47640 位、55361-56610 位、54198-54622 位、41201-41497 位的片 段;HPA-2抗原系統(tǒng)的引物擴增GenBank編號為NC_000017. 10 (4835312-4838325)序列 中的1340-1611位的片段;HPA- (3、9w、2化W)、20bw、22bw、24bw、28bw抗原系統(tǒng)的引物分 別擴增GenBank編號為NC_000017. 10 (42449550-42466873)序列中的 16284-16691 位、 13235-13816 位、6633-7131 位、11457-11833 位、15593-15977 位的片段;HPA-5、13w、18w、 25bw抗原系統(tǒng)的引物分別擴增GenBank中編號為NC_000005. 9 (52285156-52390609) 的序列中 89121-89571 位、99408-99889 位、96519-96861 位、113383-113693 位的片段; HPA-12W抗原系統(tǒng)的引物擴增GenBank編號為NC_000022. 10 (19711066-19712297)序 列中209-661位的片段;HPA-15抗原系統(tǒng)的引物擴增GenBank編號為NC_000006. 11 (74405508-74538041)序列中的107619-107872位的片段,可保證28個抗原系統(tǒng)基因的有 效擴增。擴增引物