一種從杜松果粕中提取竹柏雙黃酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種從杜松果柏中提取竹柏雙黃酮的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雙黃酮類屬于黃酮類化合物，是由2分子黃酮衍生物聚合生成的二聚物，可由不同類型的黃酮單體化合物組成。天然雙黃酮類化合物存在于銀杏和卷柏等各種維管植物中，也可通過化學(xué)方法合成新型雙黃酮類化合物。隨著國內(nèi)外研究的不斷深入，雙黃酮類化合物具有的細胞毒和抗腫瘤、抗病毒、抑菌抗炎、抗氧化和舒張血管等多種藥理活性越來越引起人們的高度重視，在化妝品、保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域也有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]竹柏雙黃酮是一類重要的雙黃酮類化合物，已分離獲得的竹柏雙黃酮包括竹柏雙黃酮A和竹柏雙黃酮B。其中，竹柏雙黃酮A是由張玉梅等(張玉梅，譚寧華，黃火強，等.墨西哥落羽杉中三個活性雙黃酮研究.[J].云南植物研究，2005,27(1):107-110.)從墨西哥落羽杉枝葉中分離得到的:將墨西哥落羽杉枝葉干燥粉碎后分別用工業(yè)石油醚、丙酮及甲醇各加熱回流提取3次，過濾后減壓濃縮，將得到的丙酮提取物用硅膠層析柱以氯仿、氯仿-甲醇(9:1?1:1)和甲醇梯度洗脫，得到組分A-L，其中組分H(22g)再分別用硅膠柱(氯仿-甲醇(6:1)、氯仿-丙酮(3.5:1))和Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇-水(1:1))反復(fù)層析，分離純化得到竹柏雙黃酮A。竹柏雙黃酮A對腫瘤細胞株HT-29的IC5q值為11.16ymol/L，有望成為新型組織蛋白酶B(CatB)的天然抑制劑。
[0004]杜松在我國華北地區(qū)及遼寧、吉林和黑龍江省的南部均有分布，杜松果為柏科植物杜松(Juniperus rigida)的成熟球果。目前杜松果常用來提取揮發(fā)油和釀酒，有發(fā)汗利尿和鎮(zhèn)痛的功效，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。但杜松果經(jīng)目前常規(guī)提取后剩余的大量杜松果柏卻被直接舍棄，不僅是資源的極大浪費，也污染了環(huán)境。
[0005]如何有效利用杜松果柏、變廢為寶是值得深思的重大問題。經(jīng)申請人檢測發(fā)現(xiàn)，杜松果的竹柏雙黃酮含量很高，目前還未見利用杜松果或杜松果柏提取竹柏雙黃酮的相關(guān)報道，而如上述從墨西哥落羽杉枝葉提取竹柏雙黃酮的方法的不足之處在于:提取過程中用到眾多種類的有機溶劑(工業(yè)石油醚、丙酮、甲醇、氯仿)，不僅使得整個提取過程較為繁瑣，而且這些有機溶劑成本高、對操作人員和環(huán)境刺激性強、毒性大。
[0006]而行業(yè)內(nèi)常規(guī)的提取方法獲得的粗提物中雜質(zhì)多，目標化合物(竹柏雙黃酮)的含量卻較低，僅為約10%，提取效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種從杜松果柏中提取竹柏雙黃酮的方法，該方法解決了現(xiàn)有技術(shù)中竹柏雙黃酮提取率低的問題。
[0008]—種從杜松果柏中提取竹柏雙黃酮的方法，包括以下步驟:
[0009](I)用體積分數(shù)為70?80 %的乙醇溶液回流提取杜松果柏，得提取液，將所述提取液減壓濃縮，得濃縮物；
[0010](2)將所述濃縮物加水稀釋，靜置后固液分離，取上清液；
[0011](3)用乙醇調(diào)節(jié)所述上清液的乙醇度至20?30%，靜置后固液分離，取沉淀；
[0012](4)將所述沉淀用稀鹽酸溶液溶解后加入到大孔吸附樹脂柱中，先用水洗脫至流出液PH值為中性，再用乙醇溶液解吸，收集解吸液，解吸液經(jīng)減壓濃縮、干燥后得到含有竹柏雙黃酮的杜松果柏提取物。
[0013]如未作特殊說明，本發(fā)明中所指的竹柏雙黃酮均為竹柏雙黃酮A。
[0014]本發(fā)明的提取方法步驟簡便，操作簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn);采用的溶劑僅為水和乙醇，不僅大大降低了提取成本，而且水和乙醇對操作人員和環(huán)境基本無刺激、無毒性，提取過程更為環(huán)保。
[0015]采用體積分數(shù)為70?80%的乙醇溶液進行回流提取，能夠有效提高濃縮物中有效成分的含量;在減壓濃縮過程中，提取液中的蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)會迅速沉淀，當(dāng)用水稀釋濃縮物后這些雜質(zhì)會沉淀分離，而有效成分則溶解在上清液中；由于竹柏雙黃酮在低濃度乙醇溶液中的溶解度較低，因此當(dāng)調(diào)節(jié)上清液的乙醇度至20?30%時，上清液中的竹柏雙黃酮則會析出并沉淀下來；當(dāng)用稀鹽酸溶液溶解沉淀并上大孔吸附樹脂柱后，酸性溶液使得其中含有的強極性雜質(zhì)無法吸附到大孔吸附樹脂上，從而最大可能地去除雜質(zhì)，有效提高杜松果柏提取物中竹柏雙黃酮的含量，獲得的杜松果柏提取物中竹柏雙黃酮的含量高達30?40%，提取效率高。
[0016]作為優(yōu)選，步驟(I)中，杜松果柏的粒度小于0.5cm。對杜松果柏進行適當(dāng)細化，有利于提高乙醇溶液的回流提取效率。
[0017]杜松果柏與乙醇溶液的重量體積比優(yōu)選為:lkg:8?10L;回流提取的次數(shù)較多能夠提高回流提取效率，優(yōu)選為重復(fù)提取兩次，每次提取時間為至少I小時。
[0018]作為優(yōu)選，步驟(2)中，將所述濃縮物加水稀釋至固形物質(zhì)量分數(shù)占5?10%。適當(dāng)?shù)南♂尡壤缺苊馍锨逡后w積過大、增加后續(xù)調(diào)節(jié)乙醇度時的乙醇用量，也能夠保證濃縮物中的蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)充分地沉淀分離。
[0019]作為優(yōu)選，步驟(3)中，調(diào)節(jié)所述上清液的乙醇度至30%。當(dāng)上清液的乙醇度為30%時，竹柏雙黃酮的溶解度最低，有利于提高提取效率。
[0020]作為優(yōu)選，步驟(4)中，所述大孔吸附樹脂柱內(nèi)填裝弱極性大孔吸附樹脂;可選用LSAlO大孔吸附樹脂。由于竹柏雙黃酮的極性為中等極性，因此使用弱極性大孔吸附樹脂時，大孔吸附樹脂對竹柏雙黃酮的吸附效率較高，解吸附完全。
[0021 ]作為優(yōu)選，步驟(4)中，所述稀鹽酸溶液的濃度為0.01?0.03%。此時上柱液的pH為3-4，上柱效率高，對強極性雜質(zhì)去除較為完全。
[0022]作為進一步優(yōu)選，所述稀鹽酸溶液的濃度為0.01%。
[0023]作為優(yōu)選，步驟(4)中，用體積分數(shù)為60?70%的乙醇溶液解吸。竹柏雙黃酮在此濃度的乙醇溶液中溶解性較高，采用該乙醇溶液洗脫時，洗脫效率高。
[0024]步驟(I)或(4)中，所述減壓濃縮的溫度為60?65°C。
[0025]步驟(4)中，所述干燥為真空干燥或噴霧干燥，干燥至所述杜松果柏提取物的水分含量不超過5%。在此水分含量下，微生物不容易繁殖，有助于延長杜松果柏提取物的保質(zhì)期。
[0026]本發(fā)明還提供了一種杜松果柏提取物，該杜松果柏提取物由本發(fā)明所述方法制備而成，含有至少30%的竹柏雙黃酮，是常規(guī)提取方法的3倍以上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0027](I)本發(fā)明的提取方法步驟簡便，操作簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)；
[0028](2)本發(fā)明的提取方法中采用的溶劑僅為水和乙醇，不僅大大降低了提取成本，而且水和乙醇對操作人員和環(huán)境基本無刺激、無毒性，提取過程更為環(huán)保；
[0029](3)本發(fā)明的提取方法能有效提高杜松果柏提取物中竹柏雙黃酮的含量，獲得的杜松果柏提取物中竹柏雙黃酮的含量高達30?40%，含量穩(wěn)定，提取效率高。
【附圖說明】
[0030]圖1為竹柏雙黃酮純品的HPLC檢測圖；
[0031 ]圖2為實施例1中杜松果柏提取物的HPLC檢測圖；
[0032]圖3為實施例2中杜松果柏提取物的HPLC檢測圖；
[0033]圖4為實施例3中杜松果柏提取物的HPLC檢測圖；
[0034]圖5為實施例4中杜松果柏提取物的HPLC檢測圖；
[0035]圖6為對比例I中杜松果柏提取物的HPLC檢測圖；
[0036]圖7為實施例5中杜松果柏提取物的HPLC檢測圖；
[0037]圖8為對比例2中杜松果柏提取物的HPLC檢測圖；
[0038]圖9為對比例3中杜松果柏提取物的HPLC檢測圖；
[0039]圖10為對比例4中杜松果柏提取物的HPLC檢測圖；
[0040]圖11為對比例5中杜松果柏提取物的HPLC檢測圖。
【具體實施方式】
[0041]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的詳細說明。
[0042]實施例1
[0043]本實施例一種從杜松果柏中提取竹柏雙黃酮的方法，包括以下步驟:
[0044](I)用體積分數(shù)為70 %的乙醇溶液回流提取杜松果柏，得提取液，將提取液減壓濃縮，得濃縮物；
[0045]具體為:①稱取干燥杜松果柏碎(粒度小于0.5cm)1kg，投入到200L提取罐中，并加入體積分數(shù)為70%的乙醇溶液100L，攪拌均勻；
[0046]②打開夾套蒸汽，加熱至有乙醇回流時，開始計時，回流提取Ih;
[0047]③回流提取完畢后，將料液過400目濾袋，取濾液備用，并向濾渣中再次投入體積分數(shù)為70%的乙醇溶液100L，重復(fù)回流提取Ih;
[0048]④回流提取完畢后，將二次料液過400目濾袋，取二次濾液與③中的濾液合并，得提取液；
[0049]⑤將提取液吸入100L外循環(huán)，打開外循環(huán)