一種草坪幣斑病菌的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病原微生物領(lǐng)域，涉及一種草坪幣斑病菌的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]草坪幣斑病菌(Sclerotinia homoeocarpa)是一種重要的植物病原真菌，其寄主種類繁多，可以侵染多種冷季型以及暖季型草坪草。自1932年首次在美國發(fā)現(xiàn)并報道以來，現(xiàn)已在全世界范圍內(nèi)分布廣泛。前期調(diào)查結(jié)果顯示草坪幣斑病在我國20多個省區(qū)均有發(fā)生。幣斑病主要危害草坪草的葉片，造成草坪草的枯黃直至死亡，嚴(yán)重影響草坪的景觀美景度。
[0003]幣斑病主要有初夏和初秋兩個發(fā)病高峰期，當(dāng)土壤溫度高于18°C、夜間濕度較大時幣斑病開始發(fā)病，發(fā)病初期在草坪上形成約硬幣大小的近圓形黃斑塊，發(fā)病嚴(yán)重時，斑塊可連接成大片的枯草區(qū)。
[0004]幣斑病菌不產(chǎn)生孢子，其初侵染來源主要包括潛伏在種子內(nèi)的病菌組織，越冬休眠的菌絲體或無侵染癥狀的植株體。病原菌多從寄主的傷口侵入，再侵染主要通過人為或機械的方式傳播。侵染后期，受侵染的草坪葉片上?；煊卸喾N腐生真菌或細(xì)菌，因此在幣斑病菌的實際分離過程中常難以快速、準(zhǔn)確的分離出目標(biāo)菌。
[0005]常規(guī)的幣斑病菌分離對病樣的采集至分離的時間要求嚴(yán)格，通常在采集的24h之內(nèi)需要進(jìn)行病原菌的分離以提高分離成功率，然而實際操作過程中，病樣采集后需要長距離運輸至實驗室才能有條件進(jìn)行病原菌的分離，此時其它病原雜菌就容易滋生，從而降低目標(biāo)菌分離成功率;此外常規(guī)的分離方法需要對病組織進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理，而消毒處理的同時可能會殺死目的病菌，致使病原菌的分離效率大大降低。為了有效開展草坪幣斑病菌抗藥性監(jiān)測、群體遺傳以及致病性等相關(guān)的研究，開發(fā)一種快速、高效的分離草坪幣斑病菌是進(jìn)行相關(guān)研究的必要前提條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高效的草坪幣斑病菌的分離方法。
[0007]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
[0008]—種草坪幣斑病菌的分離方法，包括如下步驟:
[0009](I)、病樣采集:切取具有典型幣斑病癥狀的病健交接處植株及土壤樣本作為病樣；
[0010](2)、病樣保濕培養(yǎng):將步驟(I)獲得的病樣保濕培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)條件為22-25 V光照16h/18_20°C黑暗8h交替培養(yǎng)；；
[0011 ] (3)、病原菌分離:使用接種針挑取經(jīng)過保濕培養(yǎng)后在病樣表面長出的細(xì)絲狀菌絲，置于APDA培養(yǎng)基上，22-25 0C黑暗條件培養(yǎng)2_3d ；
[0012](4)、病原菌純化:待氣生菌絲長出后，切取菌落邊緣的菌絲尖端，轉(zhuǎn)入新的APDA培養(yǎng)基上，22-250C黑暗條件培養(yǎng)3-5d，得到目的病原菌。
[0013]步驟(I)中，病樣采集工具為土壤取樣器。所述的土壤樣本的直徑為4-5cm、高度為6-lOcm。所述的病樣裝入信封中，室溫(溫度20-30°C)運輸至實驗室，置于4°C冰箱中保存。病樣裝于紙質(zhì)保存袋如信封中，運輸過程透氣不易使病樣腐爛。
[0014]步驟(2)中，將病樣置于經(jīng)過滅菌處理的花盆或穴盤中，噴施無菌水使其濕度不低于80%，優(yōu)選為88%-95%，使用封口膜密封后將病樣置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行保濕培養(yǎng)2-3d，培養(yǎng)條件為22-25°C光照16h/18-20°C黑暗8h交替培養(yǎng)。保濕培養(yǎng)的條件為草坪幣斑病菌適宜的生長條件。
[0015]所述的花盆或穴盤在80 °C下烘干2h進(jìn)行滅菌處理。
[0016]—般分離病樣時，每個樣本都需要做幾個重復(fù)以提高分離效率。步驟(3)中，使用接種針挑取草坪草或土壤表面經(jīng)過保濕培養(yǎng)后長出的細(xì)絲狀菌絲，每個病樣挑取2-4個菌絲體，置于APDA培養(yǎng)基上。
[0017]本發(fā)明所述的APDA培養(yǎng)基的制備方法為:稱取馬鈴薯200g，削皮切塊后置于去離子水中加熱煮沸20min，用雙層紗布過濾收集濾液后定容到1L，加入15g瓊脂和18g葡萄糖混勻后，121°C濕熱滅菌20min，待培養(yǎng)基溫度降至55-60°C，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為3.8-4.2。通過加入醋酸調(diào)試培養(yǎng)基的pH，并用pH試紙檢測培養(yǎng)基的pH。
[0018]本發(fā)明所述的感病植物為草地早熟禾(Poa pratensis)、匍匍剪股穎(Agrostisstolonifera)、海濱雀稗(Paspalum vaginatum)等草坪草。
[0019]本發(fā)明所述的病原菌為草坪幣斑病菌。
[0020]本發(fā)明通過對病樣進(jìn)行保濕培養(yǎng)前處理可以使幣斑病菌迅速擴展，并結(jié)合酸化APDA培養(yǎng)基的使用，可以促進(jìn)幣斑病菌生長而抑制大部分雜菌生長，從而解決幣斑病菌分離過程中各種非目標(biāo)真菌污染的問題，同時也解決病樣運輸過程中需要低溫以及病原菌分離需要快速進(jìn)行(病樣采集24小時內(nèi)分離)的要求，與常規(guī)的幣斑病菌分離鑒定方法相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0021](I)本發(fā)明使用取樣器切取的發(fā)病組織及土壤作為一整體，可保證病原菌在室溫及4°C低溫條件下長期存活，病樣采集后無需立刻進(jìn)行病原菌的分離，裝入信封中室溫條件下運輸至實驗室置于4°C冰箱保存，可以4°C冰箱中保存兩個月直至病原菌分離工作的開始，仍能有效的分離出目的病原菌，病原菌分離可分批次進(jìn)行，操作性強。
[0022](2)本發(fā)明無需對病組織進(jìn)行嚴(yán)格的表面消毒，僅需對病樣進(jìn)行簡單的保濕培養(yǎng)即可，操作簡單、方便、安全。
[0023](4)本發(fā)明病原菌分離效率高，因省去常規(guī)的病組織消毒步驟，目的病原菌存活不受影響，使得其分離效率及成功率大大提高。
[0024](5)本發(fā)明分離病原菌時無需嚴(yán)格的無菌操作環(huán)境，可在實驗室操作臺面上進(jìn)行，能同時實現(xiàn)多位人員的操作，比較適合大樣本量病原菌的分離。
【附圖說明】
[0025]圖1為病樣保濕培養(yǎng)后的草坪幣斑病菌的菌絲形態(tài)特征，其中箭頭所示為細(xì)絲狀的草坪幣斑病菌菌絲。
[0026]圖2為病樣保濕培養(yǎng)后的雜菌的菌絲形態(tài)特征，其中箭頭所示為雜菌的菌絲。
[0027]圖3為本發(fā)明方法分離草坪幣斑病菌的結(jié)果，其中箭頭所示為氣生狀態(tài)的草坪幣斑病菌，每個培養(yǎng)皿代表I個病樣的分離結(jié)果。
[0028]圖4為傳統(tǒng)方法分離草坪幣斑病菌的結(jié)果，其中箭頭所示為氣生狀態(tài)的草坪幣斑病菌，每個培養(yǎng)皿代表I個病樣的分離結(jié)果。
[0029]圖5為草坪幣斑病菌ITS的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。M = Hiaker，1-8代表不同地理來源的病樣分離得到的草坪幣斑病菌。
【具體實施方式】
[0030]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施過程進(jìn)行描述，所舉實施例只用于解釋本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。
[0031]實施例1
[0032]1、實驗方法
[0033]采用本發(fā)明方法對草坪幣斑病菌進(jìn)行分離，包括如下步驟:
[0034](I)病樣采集:使用土壤取樣器切取直徑4cm，高度6-8cm具有典型幣斑病癥狀的病健交接處植株及土壤樣本作為病樣，裝入信封中后室溫運輸，帶回實驗室后轉(zhuǎn)入4°C冰箱中保存；
[0035](2)病樣保濕處理:將步驟(I)所保存病樣取出，置于經(jīng)過滅菌處理(80°C烘干2h)的花盆或穴盤中，噴施無菌水使?jié)穸炔坏陀?0%，使用封口膜密封后將病樣置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行保濕培養(yǎng)2-3d，培養(yǎng)條件為22-25 °C光照16h/l 8_20 V黑暗8h交替培養(yǎng)；
[0036](3)病原菌分離:經(jīng)過步驟(2)保濕培養(yǎng)后，使用接種針挑取草坪草或土壤表面長出的細(xì)絲狀菌絲(如圖1所示)置于APDA培養(yǎng)基上，每個病樣挑取2-4個菌絲體，25°C黑暗條件培養(yǎng)2d;所述的APDA培養(yǎng)基的制備方法為:稱取馬鈴薯200g，削皮切塊