一種通過回接分離獲得萬壽菊黑斑病病原菌單孢系的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于病原菌的分離鑒定領域，特別涉及一種通過回接分離獲得萬壽菊黑斑 病病原菌單孢系的方法。
【背景技術】
[0002] 萬壽菊（TageteserectaL.)為菊科（Compusitae)萬壽菊屬（Tagetes) -年生 草本植物，不僅可用于城市的園林美化，同時也是提取天然葉黃素的重要原料。隨著種植面 積的不斷推廣和擴大，萬壽菊黑斑病害的發(fā)生日益嚴重，特別是氣候異常年份如連陰雨天 或高溫干旱等。北京延慶地區(qū)大面積種植的色素萬壽菊，2010年和2011年兩年病害的嚴重 發(fā)生已成為其發(fā)展的一個限制因素。在發(fā)展萬壽菊的生產中，病害已成了重要的限制因素 之一。
[0003]目前對萬壽菊黑斑病原菌的鑒定多采用傳統(tǒng)分類鑒定方法，因形態(tài)、地域的差 異，結論并不一致。我國有一些文獻上對萬壽菊黑斑病有過報道，他們都用了不同的種 名：如高潔（高潔，白慶榮，董然，等.2002.萬壽菊細菌性葉斑病的發(fā)生與病原菌鑒定 [J].吉林農業(yè)大學學報，24(2) :94-96,107)等通過形態(tài)學、生理生化性狀及生態(tài)學特 征將萬壽菊細菌性葉斑病的致病菌確定為丁香假單胞菌萬壽菊致病變種（Pseudomonas syringaepv.tagetes);王龍等則將甘肅地區(qū)萬壽菊葉斑病的病原鑒定為鏈格孢屬 (Alternariasp.)物種；王婦等通過形態(tài)鑒定將萬壽菊葉斑病的病原菌鑒定為細極鏈格孢 (A.tenuissima)〇
[0004] 上述方法所需的時間較長，操作繁瑣，得到一批菌系（7~9個單孢系）需要半年。 并且，傳統(tǒng)分類鑒定方法在分離病原菌的時候往往無法有效地剔除腐生菌，準確性有限，導 致不同人的鑒定結果不同。因此，目前的科研和實踐中需要一種操作簡便、時間短、準確性 高的萬壽菊黑斑病病原菌單孢系的分離方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明提供一種通過回接分離獲得萬壽菊黑斑病病原菌單孢系的方法。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0007] -種通過回接分離獲得萬壽菊黑斑病病原菌單孢系的方法，包括以下步驟：
[0008] 病殘植株采集步驟：
[0009] 采集田間的萬壽菊黑斑病的病殘植株；
[0010] 孢子懸液配制步驟：
[0011] 取所述病殘植株的莖段上的黑霉，配制成孢子懸液；
[0012] 回接步驟：
[0013] 將所述孢子懸液接種于萬壽菊幼苗，得到自然發(fā)病的植株；
[0014] 寄生菌分離步驟：
[0015] 選取生長于所述自然發(fā)病的植株的帶有病斑的部分，消毒后培養(yǎng)得到疑似寄生菌 的菌落；
[0016] 產孢步驟：
[0017] 將所述疑似寄生菌的菌落進行擴繁，誘發(fā)產生孢子；再將所述孢子接種于萬壽菊 幼苗驗證寄生性，選取有寄生性的菌株；
[0018] 單孢系分離步驟：
[0019] 將所述有寄生性的菌株進行單孢系分離處理，得到黑斑病病原菌單孢系。
[0020] 上述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述病殘植株采集步驟中，還將所述病殘植株進 行保濕處理。
[0021] 上述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述保濕處理為：將所述病殘植株在清水中浸泡 3-6小時，優(yōu)選為4小時，再放入濕度為100 %的密閉空間里保濕40-60小時，優(yōu)選為48小 時。
[0022] 上述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述孢子懸液配制步驟中，所述孢子懸液的孢子 濃度為5000-15000個孢子/毫升，優(yōu)選為10000個孢子/毫升。
[0023] 上述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述回接步驟中，所述接種為：將噴灑有所述孢子 懸液的萬壽菊幼苗置于封閉的保濕容器中，所述保濕容器內的空氣濕度為100%。
[0024] 上述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述回接步驟中，所述保濕容器中裝有40-60°C， 優(yōu)選為50°C的水；優(yōu)選地，所述回接步驟中，所述保濕容器中水面的高度達到裝有萬壽菊 幼苗的容器的高度的0. 3-0. 8,進一步優(yōu)選為0. 6。
[0025] 上述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述寄生菌分離步驟中，采用PDA培養(yǎng)基；所述 PDA培養(yǎng)基中，PDA培養(yǎng)基粉末的濃度為30-50g/L，進一步優(yōu)選為39g/L。
[0026] 上述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述產孢步驟中，采用玉米培養(yǎng)基；所述玉米培養(yǎng) 基中，玉米培養(yǎng)基粉末的濃度為70-80g/L，進一步優(yōu)選為75g/L。
[0027] 上述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述單孢系分離步驟中，所述單孢系分離處理為： 取所述有寄生性的菌株的產生孢子，涂布于水瓊脂培養(yǎng)基上，觀察后挑取孢子；再將挑取的 孢子于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-8天，得到所述單孢系。
[0028] 上述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述單孢系分離步驟中，水瓊脂培養(yǎng)基中，瓊脂粉 濃度為20-40g/L，進一步優(yōu)選為30g/L。
[0029] 相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0030] 1、本發(fā)明的寄生菌分離步驟采用的植株是人工回接步驟中得到的自然發(fā)病的植 株，而不是采用田間病株，寄生菌分離步驟之后僅經過一次轉皿即可用單孢進行超低溫貯 藏，獲得具有良好的活力的單胞子系。
[0031] 2、本發(fā)明得到一批菌系（7~9個單孢系）所需要時間將從半年縮短到1個月，較 前分離的速度得到顯著提高。
[0032] 3、本發(fā)明有效地剔除了腐生菌的存在，能夠準確獲得萬壽菊黑斑病病原菌。
【附圖說明】
[0033] 圖1 :實施例1中葉部帶有大型病斑的植株的照片。
[0034] 圖2 :實施例1中葉部帶有小型病斑的植株的照片。
[0035] 圖3:實施例1中莖部帶有病斑的植株的照片。
[0036] 圖4 :實施例1中PDA培養(yǎng)基平板上的疑似寄生菌的菌落。
[0037] 圖5:實施例1中顯微鏡（40x10)下看到的未接種成功的孢子（40x10)的照片。
[0038] 圖6 :實施例1中顯微鏡（40x10)下看到的接種成功的孢子（40x10)的照片。
[0039] 圖7 :實施例1中作為單孢系的孢子在PDA培養(yǎng)基平板長出的菌落的照片。
[0040] 圖8 :實施例1中萬壽菊黑斑病田間發(fā)病癥狀的照片；其中，（a) (b)為葉片發(fā)病癥 狀，（c)為莖發(fā)病癥狀，（d)為田間發(fā)病中后期。
[0041]圖9 :實施例1中萬壽菊黑斑病病原菌鑒定的照片；其中，（a)為PDA培養(yǎng)基上的 病原菌正面菌落形態(tài)，（b)為PDA培養(yǎng)基上的病原菌反面菌落形態(tài)，（c)為菌絲、孢子形態(tài) (10X20)，（d)為孢子形態(tài)（10X40)，（e)為回接后萬壽菊幼苗葉片發(fā)病癥狀，（f)為回接 后萬壽菊幼苗植株發(fā)病癥狀。
【具體實施方式】
[0042] 一種通過回接分離獲得萬壽菊黑斑病病原菌單孢系的方法，包括以下步驟：
[0043] 步驟一、病殘植株采集：采集萬壽菊雜交種幼苗的黑斑病的田間病殘植株，常溫下 干燥保存。
[0044] 在步驟三的接種前，可以保濕誘發(fā)混有雜菌的寄生菌；該保濕誘發(fā)的操作為：將 該病殘植株在無菌水中浸泡3-6小時（比如：3小時、5小時、6小時中任意或任意之間的范 圍，優(yōu)選為4小時），使病殘植株完全濕潤，再將濕潤的病殘植株放在密閉空間里保濕40-60 小時（比如：40小時、50小時、60小時中任意或任意之間的范圍，優(yōu)選為4小時），濕度為 100%〇
[0045] 步驟二、孢子懸液配制：選取黑霉比較明顯的病殘植株，刮取其莖段上的黑霉（即 混有雜菌的寄生菌），用蒸餾水配制成孢子濃度為5000-15000個孢子/毫升（比如：5000 個孢子/毫升、8000個孢子/毫升、12000個孢子/毫升、15000個孢子/毫升中任意或任意 之間的范圍，優(yōu)選為10000個孢子/毫升）的孢子懸液。
[0046] 步驟三、回接（優(yōu)選為人工回接）：將該孢子懸液接種于萬壽菊幼苗，得到自然發(fā) 病的植株。
[0047] 上述接種的操作為：
[0048] 取孢子懸液，用微型噴霧器噴灑在健康的萬壽菊幼苗上；以噴灑無菌水的健康 的萬壽菊幼苗為對照，將噴灑后所有的幼苗放入保濕桶中，為保證葉面長時間的為水膜所 覆蓋，桶內盛有40-60°C(比如：40°〇、451：、551：、601：中任意或任意之間的范圍，優(yōu)選為 50°C)的無菌水，水面高度達到種植有萬壽菊幼苗的營養(yǎng)缽高度的0.3-0. 8 (比如：0. 3、 0. 4、0. 45、0. 5、0. 7. 0. 8中任意或任意之間的范圍，優(yōu)選為0. 6);再將空氣加濕器放入保濕 桶內，然后將保濕桶封嚴，使桶內空氣濕度達到100%;待30-50小時（比如：30小時、25小 時、45小時、48小時、50小時中任意或任意之間的范圍，優(yōu)選40小時）后，從保濕桶中取出 所有的萬壽菊幼苗，讓植株自然發(fā)病，得到自然發(fā)病的植株。
[0049] 上述保濕桶優(yōu)選為60L的塑料整理箱。
[0050] 步驟四、寄生菌分離：選取生長于該自然發(fā)病的植株的帶有病斑的部分，消毒后接 種于PDA培養(yǎng)基粉末濃度為30-50g/L(比如：30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L中任意或 任意之間的范圍，優(yōu)選為39g/L)，的PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；7-10天后，得到疑似寄生菌的菌 落。
[0051] 上述PDA培養(yǎng)基的制備方法為：
[0052] 稱取PDA培養(yǎng)基粉末，用蒸餾水加熱溶解，定容，滅菌后冷卻凝固成PDA培養(yǎng)基平 板，4°C保存待用；
[0053] 上述接種的操作為：
[0054] 取自然發(fā)病的植株的葉片，用清水沖兩遍，吸水紙吸干水分，選取較典型的病斑， 剪成大約一厘米見方的小塊；再用75%酒精溶液洗30秒，然后再使用15%的次氯酸鈉溶液 消毒1~3分鐘；再用無菌水漂洗兩次后，剪成約2~3毫米見方的小塊，再用無菌水洗一 次，分別放在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。
[0055] 本步驟采用的植株是人工回接步驟中得到的自然發(fā)病的植株，而不是采用田間病 株，之后僅經過一次轉皿即可用單孢進行超低溫貯藏，可以獲得具有良好的活力的單胞子 系。
[0056] 步驟五、產孢：將該疑似寄生菌的菌落轉到玉米培養(yǎng)基粉末濃度為70_80g/L(比 如：70g/L、72g/L、76g/L、78g/L、80g/L中任意或任意之間的范圍，優(yōu)選為75g/L)，玉米培養(yǎng) 基進行擴繁，誘發(fā)產生孢子，將孢子接種于萬壽菊幼苗驗證寄生性，選取有寄生性的菌株。
[0057] 上述驗證方法按照科赫氏法則，從接種后發(fā)病的植株上再進行病原菌分離以及再 次接種，以確定分離物是否為致病菌。該玉米培養(yǎng)基的制備方法為：
[0058] 稱取玉米培養(yǎng)基粉末，用蒸餾水加熱溶解，定容，滅菌后冷卻凝固成玉米培養(yǎng)基平 板，4°C保存待用；
[0059] 上述誘發(fā)產生孢子的操作為：待菌落長滿玉米培養(yǎng)基后，采用"刮開法"誘發(fā)產生 孢子，即在無菌條件下刮除菌落表面菌系，開皿培養(yǎng)，培養(yǎng)2-6天即能產孢子。