一種仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于高分子材料領(lǐng)域，涉及一種仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡，具體涉及一種仿病毒核衣殼及表面刺突結(jié)構(gòu)的高分子囊泡及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]病毒作為結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一類(lèi)非細(xì)胞型微生物，主要由核酸分子和蛋白衣殼組成；其基本結(jié)構(gòu)有核心(核酸)和衣殼(蛋白或脂蛋白)，二者構(gòu)成核衣殼。病毒特有的衣殼結(jié)構(gòu)能屏蔽體內(nèi)循環(huán)環(huán)境中的潛在破壞因素，如核酸酶、酸堿度等，具有保護(hù)基因遺傳物質(zhì)的功能。有些病毒粒子表面(尤其是在有囊膜的病毒粒子表面)有呈放射排列的突起物，稱(chēng)刺突(也稱(chēng)囊膜突起)。這些刺突有的是病毒的凝血素(能凝集紅細(xì)胞)，用于起動(dòng)病毒感染過(guò)程，具有誘生免疫保護(hù)作用以及中和抗體的能力;有的具有神經(jīng)氨酸酶的活力，可促使病毒從宿主細(xì)胞上釋放。
[0003]受病毒結(jié)構(gòu)和功能的啟發(fā)，一直以來(lái)各種仿病毒人工自組裝納米聚集體的不斷出現(xiàn)，其中以仿病毒結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)體囊泡和高分子囊泡最為典型。它們都是由一類(lèi)由雙親性分子有序組合而成的中空球體;其球體的外殼膜層由雙親性分子構(gòu)成，內(nèi)部的親水空腔可以用于包裹藥物。在水溶液中，囊泡的膜可分為三層:兩個(gè)內(nèi)外側(cè)的親水層和一個(gè)處于內(nèi)外親水層中的疏水層，疏水層由于內(nèi)外表面的親水層而保持穩(wěn)定。相比于由磷脂小分子自組裝形成的脂質(zhì)體囊泡，高分子囊泡是由大分子量的兩親性嵌段共聚物組成，其類(lèi)病毒“核衣殼”的衣殼膜的納米結(jié)構(gòu)具有更高的穩(wěn)定性。通過(guò)嵌段共聚物設(shè)計(jì)與合成，可在尺度上實(shí)現(xiàn)從微觀到宏觀調(diào)控，可對(duì)高分子鏈進(jìn)行功能基團(tuán)接枝修飾實(shí)現(xiàn)高分子囊泡的特定功能性設(shè)計(jì)。此外，納米級(jí)(200nm以下)的高分子囊泡可以被細(xì)胞內(nèi)吞，故可采用著名的特洛伊木馬(Troian Horse)策略，用高分子囊泡包裹藥物或基因片段等，避免體內(nèi)循環(huán)環(huán)境中免疫系統(tǒng)辨識(shí)、吞噬，如核酸酶、酸堿度等。因此這類(lèi)仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡的結(jié)構(gòu)和膜的特性給它帶來(lái)許多方面的潛在應(yīng)用，比如高效納米載體、藥物控釋、納米反應(yīng)器等，在多功能藥物載體的發(fā)展及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。目前，仿病毒核衣殼的高分子囊泡已經(jīng)有多種，但帶有表面刺突結(jié)構(gòu)的高分子囊泡還未有公開(kāi)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]從天然病毒的基本結(jié)構(gòu)和特征出發(fā)，本發(fā)明的目的在于提供一種可負(fù)載藥物、生物相容性好、易于被細(xì)胞吞噬的仿病毒核衣殼及表面刺突結(jié)構(gòu)的高分子囊泡。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡的制備方法。
[0006]本發(fā)明的再一目的在于提供上述仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]—種仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡，主要由不同兩親性嵌段共聚物進(jìn)行自組裝制備而成;或者由兩親性嵌段共聚物與水溶性聚合物進(jìn)行自組裝制備而成;所述高分子囊泡具有衣殼膜結(jié)構(gòu)和膜表面的刺突結(jié)構(gòu)，所述衣殼膜結(jié)構(gòu)的內(nèi)層和外層由兩親性嵌段共聚物中親水鏈段或水溶性聚合物構(gòu)成，所述內(nèi)層和外層之間的中間層由兩親性嵌段共聚物中疏水鏈段構(gòu)成;其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。
[0009]所述囊泡的尺寸為50nm?15μηι。
[0010]所述仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡還包括負(fù)載物。
[0011]所述不同兩親性嵌段共聚物中親水鏈段的分子量2 2000Da，優(yōu)選為2000?20000Da;所述不同兩親性嵌段共聚物中疏水鏈段的分子量2 2000Da，優(yōu)選為2000Da?10000Da；
[0012]所述兩親性嵌段共聚物中親水鏈段的分子量2 2000Da，優(yōu)選為2000?20000Da;所述兩親性嵌段共聚物中疏水鏈段的分子量之2000Da，優(yōu)選為2000Da?10000Da;
[0013]所述水溶性聚合物的分子量2 2000Da，優(yōu)選為2000Da?50000Da。
[0014]所述不同兩親性嵌段共聚物是指兩種或兩種以上兩親性嵌段共聚物。
[0015]所述不同兩親性嵌段共聚物中“不同”是指兩親性嵌段共聚物間嵌段比不同(親水鏈段分子量不同和/或疏水鏈段分子量不同)但親水鏈段和疏水鏈段種類(lèi)相同，或者是指兩親性嵌段共聚物的嵌段種類(lèi)不同。
[0016]所述不同兩親性嵌段共聚物中，當(dāng)親水鏈段的分子量比為1:(0.8?1.2)時(shí)，疏水鏈段的分子量比為1: (2?50);當(dāng)疏水鏈段的分子量比為1: (0.8?1.2)時(shí)，親水鏈段的分子量比為1:(2?10)。
[0017]所述不同兩親性嵌段共聚物優(yōu)選為兩種兩親性嵌段共聚物，分別為低分子量嵌段共聚物Ax1-b-Byi與尚分子量嵌段共聚物Ax2-b_By2;當(dāng)未水鏈段分子量比xl/x2為1: (0.8?1.2)時(shí)，疏水鏈段分子量比yl/y2為I: (2?50);當(dāng)疏水嵌段分子量比yl/y2為1: (0.8?1.2)時(shí)，親水鏈段分子量比xl/x2為1: (2?10)。
[0018]所述低分子量嵌段共聚物Ax1-b-Byi與高分子量嵌段共聚物AX2-b-By2的質(zhì)量比為1:(0.1?I)。
[0019]所述兩親性嵌段共聚物中親水鏈段為聚乙二醇(PEG)、聚2-甲基丙烯酸乙氧基磷酸膽堿(PMPC)中的一種，所述疏水鏈段為聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚2-二異丙胺基乙基甲基丙烯酸酯(PDPA)中的一種。
[0020]所述兩親性嵌段共聚物優(yōu)選為PEG-b-PLA，PEG-b-PCL，PEG_b_PDPA 或 PMPC_b_PDPA中的一種以上。
[0021]所述兩親性嵌段共聚物PEG-b-PLA的合成方法為:將PEG、丙交酯(PEG和丙交酯的摩爾比為1:(0.2?5))和催化劑辛酸亞錫(PEG:辛酸亞錫的質(zhì)量比= 1000/1)—起加入有機(jī)溶劑(如:甲苯，二甲苯)中，氮?dú)夥障掠?10?160 °C恒溫反應(yīng)12?24h，然后沉析，抽濾，真空干燥后即得PEG-b-PLA嵌段共聚物。
[0022]所述兩親性嵌段共聚物PEG-b-PCL的合成方法為:將PEG加入有機(jī)溶劑(如:甲苯，二甲苯)中，加入催化劑辛酸亞錫(PEG:辛酸亞錫的質(zhì)量比= 1000/1)，氮?dú)夥障拢徛尤爰簝?nèi)酯(PEG和己內(nèi)酯單體的摩爾比為1: (0.2?5))，于110?160°C恒溫反應(yīng)12?48h，然后減壓旋蒸，沉析，抽濾，真空干燥后即得PEG-b-PCL嵌段共聚物。
[0023]所述兩親性嵌段共聚物PEG-b-H)PA的合成方法為:將2-二異丙胺基乙基甲基丙烯酸酯(DPA)單體、大分子引發(fā)劑PEG-Br、催化劑CuBr和2，2/-聯(lián)吡啶(2，2-1^?74(^1^)按摩爾比(20?30): (I?2):1:2加入到有機(jī)溶劑(甲醇、異丙醇、或甲醇-異丙醇)中，氮?dú)夥障掠?0?60°C反應(yīng)12?24h，然后沉析，然后通過(guò)水洗去催化劑，之后凍干，得到PEG-b-roPA嵌段共聚物。
[0024]所述兩親性嵌段共聚物PMPC-b-PDPA的合成方法為:將2-甲基丙烯酸乙氧基磷酸膽堿(MPC)單體、引發(fā)劑(OEG-Br)、催化劑CuBr、2，2'-聯(lián)吡啶按摩爾比(25?30): 1: 1: 2加入至押醇中，氮?dú)夥障掠?0°C恒溫反應(yīng)2h，得到PMPC聚合物，之后在反應(yīng)液中繼續(xù)加入2-二異丙胺基乙基甲基丙烯酸酯(DPA)單體(MPC:DPA單體摩爾比為1: (1.5?3))，反應(yīng)40h，然后在THF中沉析，再溶解在水中，然后凍干即得PMPC-b-PDPA嵌段共聚物。
[0025]當(dāng)仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡由兩親性嵌段共聚物與水溶性聚合物進(jìn)行自組裝制備而成時(shí)，所述兩親性嵌段共聚物中親水鏈段分子量與水溶性聚合物分子量比為1: (2?10);所述兩親性嵌段共聚物與水溶性聚合物的質(zhì)量比為1: (0.1?5)，優(yōu)選為1: (0.1?I)。
[0026]所述水溶性聚合物的分子量2 2000Da，優(yōu)選為2000Da?50000Da。
[0027]所述水溶性聚合物為聚乙二醇(PEG)，水溶性淀粉衍生物(如羧甲基淀粉)、植物膠、動(dòng)物膠、水溶性纖維素衍生物(如羥甲基纖維素、羧甲基纖維素)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或聚多肽。
[0028]所述負(fù)載物為藥物、抗體、蛋白、基因片段、熒光分子或生長(zhǎng)因子;所述藥物優(yōu)選為阿霉素(DOX);所述抗體優(yōu)選為帕尼單抗(Vectibix)、T-DMl (Kadcyla)、抗體immunoglobulin G ;所述蛋白優(yōu)選為小牛血清蛋白(BSA);所述的焚光分子為羅丹明(Rhodamine)、尼羅紅(Nile red)、藻紅蛋白(PE)或異硫氰酸焚光素(FITC)。
[0029]所述仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡的制備方法，具體步驟為:
[0030](I)高分子溶液的制備:將不同的兩親性嵌段共聚物或兩親性嵌段共聚物和水溶性聚合物加入到有機(jī)溶劑中，攪拌混勻，得高分子溶液；
[0031 ] (2)高分子溶液的處理:去除高分子溶液中有機(jī)溶劑，并加入水或PBS緩沖溶液，得到仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡;或者去除高分子溶液中有機(jī)溶劑，加入負(fù)載物與水或PBS緩沖溶液，得到負(fù)載有負(fù)載物的仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡。
[0032]步驟(I)所述攪拌的轉(zhuǎn)速為100?800r/min，攪拌時(shí)間為0.05?6h。
[0033]步驟(2)所述高分子溶液的處理有以下兩種處理方式:第一種處理方式具體包括以下步驟:在攪拌條件下，將水或PBS緩沖溶液與高分子溶液混合，得混合乳液;透析或繼續(xù)攪拌去除有機(jī)溶劑，得到仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡;或?qū)⒇?fù)載物與水或PBS緩沖溶液加入高分子溶液中，繼續(xù)攪拌，得到負(fù)載有負(fù)載物的仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡。所述繼續(xù)攪拌時(shí)間都為5?72h、整個(gè)反應(yīng)的攪拌轉(zhuǎn)速為100?700r/min，所述透析時(shí)間都為24?96h。
[0034]步驟(2)所述高分子溶液的處理的第二種處理方式具體包括以下步驟:將步驟I)的高分子溶液進(jìn)行干燥，得到復(fù)合薄膜;將水或PBS緩沖溶液加入裝有復(fù)合薄膜的裝置中，攪拌，得到仿病毒結(jié)構(gòu)高分子囊泡;或?qū)⒇?fù)載物與水或PBS緩沖溶液加入裝有復(fù)合薄膜的裝置中，攪拌，得到負(fù)載有負(fù)載物的仿病毒結(jié)構(gòu)高分子