側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔?、其制備方法及由其制備的聚合物囊泡及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔?、其制備方法及由其制備的聚合物囊泡及其應(yīng)用。側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔锿ㄟ^RAFT聚合和酯化反應(yīng)得到，其分子量分布較窄、分子量和LA取代度可控具有優(yōu)異的生物相容性，可用于控制藥物釋放體系，制備的肺癌靶向的還原敏感可逆交聯(lián)的聚合物囊泡納米藥物支持體內(nèi)穩(wěn)定長(zhǎng)循環(huán)，但在肺癌組織高富集并高效進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)快速解交聯(lián)、釋放出藥物，高效特異性地殺死癌細(xì)胞，有效抑制了皮下和原位肺癌的生長(zhǎng)而不造成毒副作用。
【專利說明】
側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔?、其制備方法及由其制備的聚合物 囊泡及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種生物相容性聚合物材料及其應(yīng)用，具體涉及一種側(cè)鏈含硫辛?；?的生物相容性雙親聚合物、其制備方法及由其制備的聚合物囊泡以及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由雙親性聚合物自組裝形成的聚合物囊泡具有非常獨(dú)特的膜結(jié)構(gòu)，其性能可調(diào)度 大，能同時(shí)裝載親水性藥物和疏水性藥物，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其是藥物控制 釋放領(lǐng)域。但由現(xiàn)有技術(shù)制備的聚合物囊泡納米載體存在體內(nèi)循環(huán)不穩(wěn)定、腫瘤細(xì)胞攝取 低、細(xì)胞內(nèi)藥物濃度低的問題，導(dǎo)致納米藥物的藥效不高，還存在毒副作用?，F(xiàn)有囊泡對(duì)穿 透能力強(qiáng)的親水性小分子抗癌藥物以及毒副作用小的親水性生物大分子藥物如蛋白藥物 和核酸類藥物的裝載效率低，極大地限制了其作為藥物載體的應(yīng)用。
[0003] 癌癥是威脅人類健康的主要?dú)⑹?，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)。肺癌在 世界上尤其是在我國的發(fā)病率居高不下。手術(shù)只能對(duì)早期的肺癌患者有利，而對(duì)于中晚期 無效。肺癌的治療存在難以早期診斷、愈后差、易轉(zhuǎn)移、易耐藥的特點(diǎn)。納米藥物是治療肺癌 的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)和希望所在。但是現(xiàn)有技術(shù)中，尚缺乏在體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定、特異性靶向肺癌、細(xì) 胞內(nèi)快速釋放藥物、毒副作用小的高效納米藥物，尤其是缺少能夠運(yùn)輸親水性小分子抗癌 藥物的生物相容性優(yōu)異的納米載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種側(cè)鏈含硫辛?；纳锵嗳菪噪p親聚合物、由其制備的 聚合物囊泡、及其作為抗肺癌藥物的載體在制備肺癌靶向治療藥物中的應(yīng)用。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體的技術(shù)方案為:一種側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔?，結(jié)構(gòu) 式如下：
R2、R3選自以下方案之一： ① R2、R3同為H; ② R2為CH3, R3為H或者以下基團(tuán)中的一種：
P(HPMA-LA)鏈段的分子量是PEG鏈段分子量的3~10倍，PIon鏈段的分子量是PEG鏈段 分子量的30%~70%。
[0006] 本發(fā)明公開的側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物主體為PEG-P(HPMA-LA)-PIon,為三嵌段 聚合物，疏水嵌段為側(cè)鏈含硫辛?；腜(HPMA-LA)鏈段，即嵌段B，其中xy重復(fù)單元無規(guī)共 聚;還包括PEG鏈段(嵌段A)和在生理?xiàng)l件下可電離的PIon鏈段(嵌段C);
B的分子量是A分子量的3~10倍，C的分子量是A分子量的30%~70%。
[0007] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，上述側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式中，Rl選自以下基 團(tuán)中的一種：
所述m為113~170，PIon鏈段的分子量是PEG鏈段分子量的35%~50%。
[0008] 上述側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物的制備包括以下步驟： (1) 在氮?dú)猸h(huán)境下，氮二羥丙基甲基丙烯酰胺、聚乙二醇化合物和有機(jī)引發(fā)劑溶在有機(jī) 溶劑中；然后于密封反應(yīng)器里，60~70°C反應(yīng)1~3天;然后將反應(yīng)物在冰乙醚中沉淀，再經(jīng) 抽濾并真空干燥濾餅得到PEG-PHPM; (2) 氮?dú)猸h(huán)境下，將PEG-PHPMA和有機(jī)引發(fā)劑溶在有機(jī)溶劑里，然后加入2-(二甲基氨 基）甲基丙烯酸乙酯；然后于密封反應(yīng)器里，60~70°C反應(yīng)1~3天;然后將反應(yīng)物在冰乙醚 中沉淀，再經(jīng)抽濾并真空干燥濾餅得到PEG-PHPMA-PDMA; (3) 在氮?dú)猸h(huán)境下，硫辛酸溶在有機(jī)溶劑中，配制硫辛酸溶液;將N，N-二環(huán)己基碳二亞 胺于有機(jī)溶劑中，配制N，N-二環(huán)己基碳二亞胺溶液;然后冰水浴下，將N，N-二環(huán)己基碳二亞 胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室溫反應(yīng)10~15小時(shí);反應(yīng)結(jié)束后，過濾反 應(yīng)液，得到硫辛酸酐溶液； (4) 氮?dú)猸h(huán)境下，將硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶的有機(jī)溶劑中，密封條 件下，于30°C反應(yīng)1~3天;然后將反應(yīng)物在冰乙醚中沉淀，再經(jīng)抽濾并真空干燥濾餅得到側(cè) 鏈含硫辛酰基的聚合物。
[0009] 上述技術(shù)方案中，有機(jī)引發(fā)劑一般為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈等;有機(jī)溶劑可 以為四氫呋喃，N，N_二甲基甲酰氨，甲酰氨，二氯甲烷，二甲亞砜等。
[0010] 本發(fā)明中，疏水嵌段為側(cè)鏈含硫辛?；腜HPMA，即嵌段B，可表示為P(HPMA-LA)， 由PHPMA中N-2-羥丙基甲基丙烯酰胺單元的羥基酯化反應(yīng)制備得到，取代度為50~100,為 無規(guī)共聚物鏈段。本發(fā)明的側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔锏挠H水段PEG的末端可以化學(xué)偶聯(lián)肺 癌特異性靶向分子如六11^、(31^0、(^60、〇：-9或者0??33等多肽來制備得到肺癌特異靶向的 聚合物，具備雙親性、生物相容性。這樣的聚合物形成的納米囊泡具有很好的穩(wěn)定性，較高 的裝載效率，同時(shí)可以特異性地靶向到肺癌細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明還公開了一種聚合物囊泡，可以由上述側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔镏苽涞?到;或者由上述肺癌特異靶向的聚合物制備得到；或者由上述側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔锱c 肺癌特異靶向的聚合物制備得到，比如上述側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔锖头伟┨禺惏邢虻木?合物按照不同比例混合，可制備具有不同靶向密度的聚合物囊泡，即得到肺癌靶向囊泡，可 以增加載藥囊泡在肺癌細(xì)胞中的攝取量;也可以由側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物制備的聚合物 囊泡外表面偶聯(lián)肺癌細(xì)胞特異性革G向分子來制備肺癌革El向聚合物囊泡，以增加肺癌細(xì)胞的 攝取量，比如在囊泡的PEG端通過酰胺化反應(yīng)鍵合靶向多肽如Ani s、cRGD、cNGQ、CC-9或者 CPP33〇
[0012] 本發(fā)明公開的側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔锞哂袃?yōu)異的生物相容性，其疏水部分(P (HPMA-LA))的分子量是親水部分(PEG)分子量的3~10倍，可通過溶劑置換法來制備得到聚 合物囊泡，可在催化量的還原劑如二硫代蘇糖醇(DTT)或谷胱甘肽(GSH)存在的條件下，制 備得到交聯(lián)聚合物囊泡或者肺癌靶向交聯(lián)聚合物囊泡，粒徑70~180納米，可以作為治療肺 癌的藥物的載體;可以在囊泡的疏水膜中裝載疏水性小分子抗肺癌藥物紫杉醇(PTX)、多西 紫杉醇(DTX)等，也可以在囊泡的大的親水內(nèi)腔中裝載親水性抗肺癌藥物，尤其是親水性小 分子抗癌藥物如甲氨喋呤鈉鹽(MTX · 2Na)、培美曲塞鈉鹽(PEM · Na)、鹽酸多柔比星(D0X · HC1)、鹽酸表阿霉素 (Epi · HC1)、鹽酸伊利替康(CPT · HC1)和鹽酸米托蒽醌(ΜΤ0 · HC1)，也 可以在囊泡的疏水膜中裝載生物藥物如蛋白質(zhì)、多肽和核酸類藥物。這樣克服了現(xiàn)有的由 雙親性聚合物形成的膠束載體只能裝載疏水藥物和現(xiàn)有技術(shù)中沒有能高效裝載親水性小 分子抗癌藥物、并穩(wěn)定體內(nèi)循環(huán)的相容性載體的缺陷；尤其是本發(fā)明的側(cè)鏈含硫辛?；?聚合物用作藥物載體時(shí)，可以裝載現(xiàn)有雙親聚合物無法裝載的生物藥物，而且體內(nèi)循環(huán)效 果良好、病灶部位藥用效果好。
[0013] 本發(fā)明公開的交聯(lián)聚合物囊泡在疏水膜內(nèi)形成了穩(wěn)定的化學(xué)交聯(lián)，從而可在體內(nèi) 穩(wěn)定長(zhǎng)循環(huán)；但內(nèi)吞進(jìn)入癌細(xì)胞后可在細(xì)胞內(nèi)還原性環(huán)境下，快速解交聯(lián)，快速釋放出藥 物，高效殺死肺癌細(xì)胞。所以本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)上述聚合物囊泡在制備治療肺癌的藥物中的 應(yīng)用;進(jìn)一步的，本發(fā)明還公開了上述側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔镆约胺伟┨禺惏邢虻木酆?物在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用;基于本發(fā)明聚合物制備的抗肺癌藥物為囊泡抗肺癌納 米藥物。
[0014] 由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1.本發(fā)明利用聚乙二醇為引發(fā)劑、通過活性RAFT聚合順序共聚氮二羥丙基甲基丙烯 酰胺及（甲基)丙烯酸酯類單體得到分子量可控、分子量分布較窄聚合物，再和硫辛酸酐發(fā) 生酯化反應(yīng)得到取代度可控的側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔?，豐富了雙親生物相容性聚合物的 種類。
[0015] 2.本發(fā)明公開的側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔锞哂袃?yōu)異的生物相容性可以制備聚合 物囊泡和肺癌靶向聚合物囊泡，裝載不同性質(zhì)的藥物，尤其是生物藥物;并可以形成二硫鍵 交聯(lián)，得到穩(wěn)定的交聯(lián)聚合物囊泡納米藥物，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中納米藥物體內(nèi)循環(huán)不 穩(wěn)定、藥物易早釋、造成毒副作用的缺陷。
[0016] 3.本發(fā)明公開的交聯(lián)聚合物囊泡納米藥物，其交聯(lián)可逆性，即支持體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)， 可在肺癌細(xì)胞高富集;但是進(jìn)入肺癌細(xì)胞內(nèi)后卻可以快速解交聯(lián)，釋放出藥物，實(shí)現(xiàn)高效特 異性地殺死肺癌細(xì)胞而不具有毒副作用；克服了現(xiàn)有技術(shù)中交聯(lián)的納米藥物過于穩(wěn)定、而 在細(xì)胞內(nèi)藥物釋放緩慢、造成耐藥性的缺陷；聚合物囊泡可在制備過程中形成還原敏感的 二硫鍵交聯(lián)，制備方法簡(jiǎn)便，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中制備交聯(lián)納米藥物時(shí)需要復(fù)雜的操作 和提純過程等缺陷。
[0017] 4.本發(fā)明公開的側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物自組裝制備的交聯(lián)聚合物囊泡可用于 親水抗癌藥物包括親水小分子抗癌藥物和蛋白質(zhì)、多肽和核酸等生物藥物的控制釋放體 系，從而克服了現(xiàn)有納米膠束載體僅適用裝載疏水藥物的缺陷和現(xiàn)有技術(shù)中沒有能高效裝 載、并穩(wěn)定體內(nèi)循環(huán)的親水性抗癌藥物的缺陷；進(jìn)一步地，可鍵合革G向分子，在肺癌的高效 靶向治療方面具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0018] 圖 1 為實(shí)施例一中PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k的氫核磁譜圖； 圖 2為實(shí)施例二中 An i S-PEG7.5k-P (HPMA12. Ok-LA) -PDMA2.3k的核磁譜圖； 圖3為實(shí)施例六中交聯(lián)囊泡PEG5k-P(HPMA11.9k-LA)-PDMA1.8k的粒徑分布(A)及透射 電子顯微鏡圖（B)，交聯(lián)囊泡穩(wěn)定性(C、D、E)及還原響應(yīng)性測(cè)試(Π 圖； 圖4為實(shí)施例十中載MTX · 2Na交聯(lián)囊泡Anis-PEG5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k和 PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k的體外釋放圖； 圖 5為實(shí)施例十四中靶向交聯(lián)囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k/PEG5k-P(HPMA11.9k-LA)-H)MAl. 8k對(duì)H460肺癌細(xì)胞的毒性結(jié)果圖； 圖6為實(shí)施例十五中載MTX · 2Na不同靶向交聯(lián)囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k/PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k對(duì)H460細(xì)胞的毒性結(jié)果圖； 圖7為實(shí)施例十五中載MTX · 2Na 50%靶向交聯(lián)囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k/PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k對(duì)H460細(xì)胞的毒性結(jié)果圖； 圖8為實(shí)施例十六中載MTX · 2Na靶向交聯(lián)囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k/PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k在小鼠體內(nèi)的血液循環(huán)研究結(jié)果圖； 圖 9 為實(shí)施例十七中靶向交聯(lián)囊泡PEG5k-P(HPMA9k-LA)-PAA2.4k-Cy5/Anis-PEG7.5k-P(HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k在小鼠體內(nèi)血液循環(huán)研究結(jié)果圖； 圖10為實(shí)施例十八中載MTX*2Na靶向交聯(lián)囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2 · 3k/PEG5k-P(HPMAl 1 · 9k-LA)-PDMAl · 8k在荷肺癌皮下瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布圖； 圖11為實(shí)施例十九中載Cy5-CC靶向交聯(lián)囊泡PEG5k-P(HPMA9k-LA)-PAA2.4k-Cy5/ An i S-PEG7.5k-P (HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k在荷肺癌皮下瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布圖； 圖12為實(shí)施例二十中載MTX*2Na靶向交聯(lián)囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k/PEG5k-P(HPMAl 1.9k-LA)-PDMAl. 8k在荷肺癌皮下瘤裸鼠體內(nèi)的抑瘤情況圖，其 中A為腫瘤生長(zhǎng)曲線，B為小鼠治療后腫瘤圖片，C為體重變化，D為生存曲線； 圖 13 為實(shí)施例二^-一中載GrB靶向交聯(lián)囊泡PEG5k-P(HPMA9k-LA)-PAA2.4k/Anis-PEG7.5k-P(HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k在荷肺癌皮下瘤裸鼠體內(nèi)的腫瘤抑制情況圖，其中A為 腫瘤生長(zhǎng)曲線，B為小鼠治療后腫瘤圖片，C為體重變化，D為生存曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述： 實(shí)施例一合成三嵌段聚合物PEG5k-P(HPMAl1.9k-LA)-PDMAl. 8k 首先合成三嵌段聚合物PEG5k-PHPMAl 1.9k-roMAl. 8k:在氮?dú)猸h(huán)境下，0.28 g( 1.96 mmol)氮二羥丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)單體和0.1 g(20 μπιο?)的PEG-CPADN，0.49 mg AIBN (3 μπιο?)溶在4.5 mL四氫呋喃中，加入密封反應(yīng)器里，繼續(xù)通氮?dú)?0分鐘后，接著把反應(yīng)器 密封好，70 °C油浴中反應(yīng)2天。而后將產(chǎn)物PEG-PHPMA在冰乙醚中沉淀，抽濾并真空干燥得 至丨JPEG5k-PHPMAll·9k，產(chǎn)率為83%。 1H匪R(400 MHz，DMS0-d6):PEG:δ3·23,3·51; PHPMA: δ 0.8-1.02，2.89，3.68,4.71。核磁計(jì)算出下式中??=114，η=83<^Ρ(：測(cè)分子量： 15·2kDa，分子量分布：l·09。氮?dú)猸h(huán)境下，將0·lg(5·95μmol)PEG5k-PHPMAll·9k聚合 物和0.15 mg AIBN (0.89 μπιο?)溶在0.33 mL DMF里，加入到密閉反應(yīng)中，再向其中加入 25.5yL 2-(二甲基氨基）甲基丙烯酸乙酯(DMA，0.15 mmol)，攪拌至溶解，繼續(xù)通氮?dú)?0分 鐘，把反應(yīng)器密封好，70 °C油浴中反應(yīng)2天。而后將產(chǎn)物在冰乙醚中沉淀，抽濾并真空干燥 得到PEG5k-PHPMAll.9k-PDMAl.8k，產(chǎn)率為71%</Η NMR (400 MHz, DMS〇-d6):PEG:S 3.23， 3.51; PDMA: δ 0.8-1.02，2.27,4.25。核磁計(jì)算出下式中 111=114，11=83，口=12。6?(：測(cè)分子 量：16.0 kDa，分子量分布：1.15。
[0020] 然后通過酯化反應(yīng)制備最終三嵌段側(cè)鏈含硫辛?；酆衔铩Ｔ诘?dú)猸h(huán)境下，0.18 g (0.87 mmol)硫辛酸(LA)溶在2 mL二氯甲烷中，加入兩頸瓶?jī)?nèi)攪拌至溶解，0.11 g(0.52 mmol)N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)于I mL二氯甲烷中，冰水浴下，將其逐滴加入LA溶液中。 繼續(xù)通5分鐘氮?dú)猓瑢深i密封好，室溫下，反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，過濾掉反應(yīng)產(chǎn)生的沉 淀。將硫辛酸酐（LAA)溶液濃縮至0.5 ml，氮?dú)猸h(huán)境下，加入到100 mg(5.4 ymol)PEG5k-PHPMAll.9k-PDMAl.8k及53.7 mg(0.44 mmol)DMAP的3.35 mL二甲亞砜溶液中，繼續(xù)通5分 鐘氮?dú)?，密封燒瓶，置?0°C油浴中反應(yīng)48 h。而后將產(chǎn)物在冰乙醚中沉淀，抽濾并真空干 燥得到PEG5k-P (HPMA11.9k-LA) -PDMA1.8k，產(chǎn)率為74.7%。附圖 1 為其核磁圖譜，1H (400 MHz, DMS〇-d6):PEG: δ 3.23 和3·51;ΡΗΡΜΑ:δ 〇·8-1·13,3·14,3·67,4·71 and 4.83; PDMA (δ 1·3-1·8,2·27,2·64,4·18); LA:S 1·40，1·58-1·69,2·29，1·89/2·43， 3.02，和3.74。核磁計(jì)算出，χ=79，y=4。取代度(DS，指PHPMA中每100個(gè)羥基被取代的LA的個(gè) 數(shù))是96。
[0021]實(shí)施例二合成靶向聚合物 Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k 用合成的大分子RAFT試劑Anis-PEG-CPADN作為鏈轉(zhuǎn)移劑，然后同實(shí)施例一方法制備聚 合物。分三步制備An i s-PEG-CPADN。首先NHS活化的對(duì)茴香酸(An i s-NHS )的制備:室溫下，將 4.96 g(24.0 mmol)N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的30 mL四氫呋喃溶液逐滴加入到3.04 g(20.0 mmol)茴香酸和2.76 g(24.0 mmol)N-羥基琥珀酰亞胺的70 mL四氫呋喃溶液中，滴 加結(jié)束后，密閉兩頸瓶，繼續(xù)反應(yīng)12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去白色沉淀，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)，得到白色粗產(chǎn)品。向粗產(chǎn)品中加入250 mL異丙醇重結(jié)晶，得到白色針狀晶體，產(chǎn)率為 94%。咕 NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08 (d， 2H), 6.96 (d， 2H), 3.69 (s， 3H), 2.89 (s, 2H)。經(jīng)核磁分析，對(duì)茴香酸全部被活化成Anis-NHS。接著，通過酰胺化反應(yīng)制備Anis-NHS功能化的PEG(Ansi-PEG-OH)。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將α-氨基-ω-羥基聚乙二醇鹽酸鹽(!10^^6-NH2'HCl，M n=7500 g/mol，300 mg，0.04 mmol)溶解在干燥的DCM(3 mL)中，隨后在0°C下加入 三乙胺（4.45 mg，0.044 mmol)，攬摔30min后將Anis_NHS(10.97 mg，0.044 mmol)的DCM溶 液緩慢滴加到混合反應(yīng)溶液中，滴加完畢后，轉(zhuǎn)移至室溫繼續(xù)攪拌反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束 后，混合物用冷無水乙醚/乙醇(體積比99/1)沉淀，真空干燥一天得到白色固體，產(chǎn)率:94% !1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.77 (ArH-CO-), 6.90 (ArH-OCH3), 3.84 (ArH-OCH3), 3.63 (PEG) Jnis-NHS的取代度通過氫核磁譜圖計(jì)算，接近100%。第三步制備Anis-PEG-CPADN:氮?dú)猸h(huán)境下，將29 · 6mg 4-氰基戊酸二硫代萘甲酸酯（CPADN，0 · 09 mmol)和37 · 2mg (0.18 mmo I)DCC溶解在DCM中，預(yù)先攪拌12小時(shí)后，向溶液中加入5.5mg的DMAP(0.045 mmol)和2ml的Anis-PEG-〇H( 10 · 97mg，0 · 044mmol)的DCM溶液，繼續(xù)反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束 后，混合物用冷無水乙醚/乙醇（體積比99/1)沉淀，真空干燥一天得到白色固體。產(chǎn)率： 80.5%;咕匪1?(400 1抱，〇)(：13):6 8.20，7.90 311(17.50(仙口吐1^16116)，7.78(八也-C0-)， 6.90 (ArH-OCH3), 4.27 (-0CH2CH20C0-), 3.84 (ArH-OCH3), 3.63 (PEG) and 1.99 (-C(CN) (CH3)-S-) XPADN的取代度通過比較核磁積分計(jì)算出為98%。
[0022] 而后，以Anis-PEG-CPADN來作為鏈轉(zhuǎn)移劑、HPMA和DMA為單體、同實(shí)施例一制備得 到三嵌段側(cè)鏈含硫辛?；姆伟┨禺惏邢虻木酆衔顰nis-PEGT.SkKHPMAU.Ok-UO-pDMASJk。附圖 2 為其核磁圖譜，1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 7.78， 6.90 (茴香酰胺 ）， 6.03 (芳酸質(zhì)子），5.83 (Ar-CH-), 4.17 (-COOOfeC-), 3.89 (-OCH2CCH-2O-)，3.75 (Ar-OCH3), 3.65 (PEG), PHPMA: δ 0.8-1.13, 3.14, 3.67, 4.71, and 4.83; PDMA: δ 1.3-1.8, 2.27，2.64，4.18;硫辛酸：δ 1.40，1.58-1.69，2.29，1.89/2.43, 3.02， and 3· 74。核磁計(jì)算出下式中 111=170，1=84,7=0，口=15，1+7為11，取代度03=100。
[0023] 實(shí)施例三合成靶向聚合物 Anis-PEG7.5k-P(HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k 按照實(shí)施例二的方法、以HPMA和丙烯酸(AA)為單體，可以合成三嵌段側(cè)鏈含硫辛?；?肺癌特異靶向的聚合物Anis-PEG7·5k-P(HPMA9·2k-LA)-PAA2·4k。1H匪R(600 MHz， CDCl3): δ 7.78，6.90 (茴香酰胺），6.03 (芳酸質(zhì)子），5.83(厶廣01-)，4.17(-COOCH2C-), 3.89 (-OCH2CCH-2O-), 3.75 (Ar-OCH3), 3.65 (PEG), PHPMA: δ 0.8-1.13, 3.14，3.67，4.71，and 4.83; PAA (δ 1.53-1.74, 2.20);硫辛酸：5 1.40，1.58_ 1.69，2.29，1.89/2.43，3.02，and 3.74。核磁計(jì)算出下式中m=170，x=4，y=21，p=33。?^ 代度DS=67。
[0024] 實(shí)施例四合成三嵌段聚合物 N3-PEG10k-P(HPMA21.0k-LA)-PDPA6.2k 如實(shí)施例二合成分三步。第一步，以N3-PEG10k-OH為原料制備大分子RAFT試劑N3-PEGlOk-CPADN，第二步以HPMA和2-(二異丙基氨基）甲基丙烯酸乙酯(DPA)為單體、RAFT聚合 制備NS-PEGlOk-I3HPMASl . 0k-PDPA6.2k;第三步，酯化反應(yīng)接枝LA得到N3-PEG10k-P (HPMA21 · 0k-LA)-PDPA6 · 2k。核磁計(jì)算出 x=75，y=72，p=29，DS=51，m=227。
[0025]
采用上述類似的制備方法，可以制備多種側(cè)鏈含不同接枝量硫辛?；⒌谌抖?C嵌 段)為PDMA(2-(二甲基氨基）甲基丙烯酸乙酯）、PDEA(2-(二乙基氨基）甲基丙烯酸乙酯）、 Η)ΡΑ(2-(二異丙基氨基）甲基丙烯酸乙酯）、PAA(聚丙烯酸)和PMA(聚甲基丙烯酸）的生物相 容性雙親聚合物，具體原料比例以及表征見表1。
[0026] 表1各個(gè)聚合物制備條件、產(chǎn)物的核磁結(jié)果
實(shí)施例五合成靶向聚合物cRGD-PEG4k-P(HPMA6. lk-LA)-PMA2.0k 如實(shí)施例四合成分三步制備N3-PEG4k-P(HPMA6.1k-LA)-PMA2.0k。第一步如實(shí)施例二， 以N3-PEG4k-OH為原料制備大分子RAFT試劑N3-PEG4k-CPADN，第二步以HPMA和甲基丙烯酸 (MA)為單體、RAFT聚合制備N3-PEG4k-PHPMA6. lk-PMA2. Ok;第三步如實(shí)施例二、酯化反應(yīng)接 枝LA得到N3-PEG4k-P(HPMA6.1k-LA)-PMA2.0k，LA的DS為55。然后，和炔基修飾的環(huán)狀多肽 cRGD(cRGDfK)發(fā)生銅催化的疊氮-炔基Husigen環(huán)加成反應(yīng)（即點(diǎn)擊反應(yīng)）。先將一定量 CuS〇4'5H20(0.12 mmol)、抗壞血酸鈉(0.24 mmol)及炔基修飾的環(huán)狀多肽cRGD (1.2 mmol) 溶在DMF中，加入N3-PEG4k-P(HPMA6.1k-LA)-PMA2.0k (I mmol)的DMF(5 mL)溶液，室溫下 反應(yīng)24小時(shí)，得到最終的靶向聚合物。
[0027] 按照上述類似的方法，使用炔基修飾的cNGQ (cNGQGEQc，cyclic)、CC_9 (CSNIDARAC,cyclic)或CPP33 (RLffMRWYSPRTRAYG)等多肽分子替換炔基修飾的環(huán)狀多肽 cRGD，發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)可以制備不同靶向分子的共聚物，（cNGQ-PEG-P(HPMA-LA)-PMA、 CC-PEG-P (HPMA-LA) -PMA 和 CPP-PEG-P (HPMA-LA) -PMA )。更換不同的第三嵌段(C嵌段），可以 得到多種三嵌段側(cè)鏈含硫辛?；伟┨禺惏邢虻木酆衔铮╟NGQ-PEG-P(HPMA-LA)-PDEA、 CC-PEG-P(HPMA-LA)-PDPA和CPP-PEG-P(HPMA-LA)-PDMA) 實(shí)施例六制備聚合物交聯(lián)囊泡 將I mg PEG5k-P(HPMA11.9k-LA)-PDMA1.8k溶在ImL DMF中，配成I mg/mL的溶液，氮?dú)?條件下，加入10 mM的DTT溶液，密封小瓶子，室溫下攪拌10小時(shí)使之溶解。然后將該溶液置 于透析袋(麗〇)3500)內(nèi)，在2〇1^磷酸鹽緩沖溶液(？8,5 11^，？!17.4)中靜置透析2小時(shí)(最 終DTT濃度為0.5 mM);而后將其在大量透析介質(zhì)(PB，5 mM，pH 7.4)中透析24小時(shí)，換五次 水。得到的交聯(lián)聚合物囊泡的尺寸由動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀(DLS)測(cè)的形成的納米囊泡為 170 nm，粒徑分布很窄，見圖3A，由圖3B可知，TEM測(cè)得納米粒子為中空的囊泡結(jié)構(gòu)，交聯(lián)聚 合物囊泡在高濃度鹽、高倍稀釋和胎牛血清存在下仍然保持不變的粒徑和粒徑分布（圖3C、 圖3D、圖3E)，但在模擬腫瘤細(xì)胞還原環(huán)境下快速釋放，解交聯(lián)（圖3F)。由此可知，得到的交 聯(lián)囊泡具有還原敏感的解交聯(lián)的性質(zhì)，適用于藥物載體。
[0028]實(shí)施例七制備Anis為靶向分子的靶向交聯(lián)囊泡 在 I mL DMF 中按一定質(zhì)量比將PEG5k-P (HPMA11 · 9k-LA) -PDMA1 · 8k和An i s-PEG7 · 5k-P (HPMA12.0k-LA)-roMA2.3k溶解，如實(shí)施例六制備交聯(lián)囊泡。靶向聚合物的PEG分子量比非 靶向的PEG要長(zhǎng)，保證靶向分子更好的支出表面。兩者按不同比例混合可制備表面具有不同 靶向分子的交聯(lián)囊泡，PEG5k-P(HPMA11.9k-LA)-PDMA1.8k含量為50 wt.%，DLS測(cè)定靶向交 聯(lián)囊泡尺寸為174 nm左右，粒徑分布較窄。
[0029] 實(shí)施例八制備cNGQ多肽為靶向分子的的靶向交聯(lián)囊泡 室溫下向950 yL的I3B (5 mg/mL)緩沖溶液中加入50 yL濃度為5mg/mL的PEG5k-P (HPMA9·0k-LA)-PMA2·Ok和CNGQ-PEG6·0k-P(HPMA9·0k-LA)-PMA2·Ok 的DMSO溶液，緩慢轉(zhuǎn) 動(dòng)混合液，使之逐漸形成一相。2小時(shí)分散均勻后，將納米粒通氮?dú)?0min，加入10%的DTT溶 液，37°C恒溫?fù)u床中震蕩（200 rpm)24 h，使之充分交聯(lián)。然后轉(zhuǎn)入透析袋(MWC0: 3500 Da)，室溫下透析24 h除去有機(jī)溶劑，透析介質(zhì)為磷酸鹽緩沖溶液(5 mM，pH 7.4)，期間至少 換5次介質(zhì)。PEG5k-P(HPMA9.0k-LA)-PMA2.0k含量為5-30wt.%。DLS測(cè)定靶向交聯(lián)囊泡尺寸 為80 nm左右，粒徑分布較窄。
[0030] 實(shí)施例九制備cRGD多肽為靶向分子的的靶向交聯(lián)囊泡 將 PEG5k-P( HPMAl 0 · Ok-LA)-PDEA2 · 5k 和 N3-PEG1 Ok-P(HPMAK) · Ok-LA )-PDEA2 · 6k 按一 定質(zhì)量比溶在I mL DMF中，如實(shí)施例六制備交聯(lián)聚合物囊泡。兩者按不同比例混合可制備 表面具有不同N3基團(tuán)密度的交聯(lián)聚合物囊泡。然后，通過和大環(huán)炔基官能化的多肽如cRGD、 cNGQ、CPP33等發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，制備具有不同靶向分子密度的交聯(lián)囊泡。DLS測(cè)定靶向交 聯(lián)囊泡尺寸為130-174 nm左右，粒徑分布較窄。
[0031 ]實(shí)施例十交聯(lián)囊泡裝載甲氨蝶呤鈉鹽及體外釋放 用溶劑置換法制備聚合物囊泡、載藥交聯(lián)囊泡制備、空囊泡的制備方法類似。具體為， 將I mg 的PEG5k-P(HPMAl1·9k-LA)-PDMAl·8k和Anis-PEG7·5k-P(HPMA12·Ok-IJO-pDMAS.Sk 溶在 ImL DMF 中 ，配成 I mg/mL 的溶液，氮?dú)鈼l件下，加入 10 mM 的 DTT 溶液，密封小 瓶子，室溫下攪拌10小時(shí)。向聚合物溶液中加入甲氨蝶呤鈉鹽(MTX· 2Na)的I3B (5 mg/mL)溶 液，然后將該溶液于透析袋(11〇)3500)內(nèi)，于20 1^磷酸鹽緩沖溶液(？8,5 1111，？!17.4)中 靜置透析2小時(shí)；而后將其在大量透析介質(zhì)(PB，5 mM，pH 7.4)中透析24小時(shí)，換五次水。載 不同比例的藥（10%_30wt%)的交聯(lián)聚合物囊泡的粒徑在130-150 nm，粒徑分布在0.15- 0.19。紫外光光譜儀測(cè)定MTX· 2Na的包裹效率為62%-86%。得到的載藥囊泡命名為MTX-AniS-RCCPs，表示載的藥物為MTX· 2Na，靶向分子為Ani s，其他命名以此類推。
[0032] MTX'2Na的體外釋放實(shí)驗(yàn)在37 °C恒溫?fù)u床中震蕩（200 rpm)進(jìn)行，每組各有三個(gè) 平行樣。第一組，載MTX'2Na的交聯(lián)囊泡在加入10 mM GSH模擬細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境I3B (10 mM， pH 7.4)中；第二組，載MTX'2Na的交聯(lián)囊泡在I3B (10 mM，pH 7.4)中；載藥交聯(lián)囊泡的濃 度為100 mg/L，取0.5 mL放入透析袋(MWC0: 12,000)中，每個(gè)試管中加入相應(yīng)的透析溶劑 25 mL，在預(yù)定的時(shí)間間隔，取出5.0 mL透析袋外部介質(zhì)用作測(cè)試，同時(shí)向試管中補(bǔ)加5.0 mL相應(yīng)介質(zhì)。使用熒光儀測(cè)定溶液中藥物濃度。附圖4為MTX· 2Na累積釋放量與時(shí)間的關(guān) 系，從圖中可以看出，加入模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH后，其釋放明顯要快于沒加 GSH的樣本，說明 載藥交聯(lián)囊泡在10 mM的GSH的存在下，能有效釋放藥物。
[0033]實(shí)施例^^一靶向交聯(lián)囊泡載親水藥物PEM'Na及體外釋放 將PEG5k-P(HPMAl1·9k-LA)-PDMAl·8k和Anis-PEG7·5k-P(HPMA12·0k-LA)-PDMA2·3k按 質(zhì)量比1:1溶在ImL DMF中，配成I mg/mL的溶液，氮?dú)鈼l件下，加入10 mM的DTT溶液，密封小 瓶子，室溫下攪拌10小時(shí)。向聚合物溶液中加入培美曲塞鈉鹽(PEM·Na)的I3B (5 mg/mL)溶 液，然后將該溶液于透析袋(11〇)3500)內(nèi)，于20 1^磷酸鹽緩沖溶液(？8,5 1111，？!17.4)中 靜置透析2小時(shí)；而后將其在大量透析介質(zhì)(PB，5 mM，pH 7.4)中透析24小時(shí)，換五次水。載 不同比例的藥（10%_30wt%)的交聯(lián)聚合物囊泡的粒徑在120-150 nm，粒徑分布在0.15-0.19。紫外光光譜儀測(cè)定PEM'Na的包裹效率為70%-88%，得至IjPEM-Anis-RCCPs JEM'Na的體外 釋放實(shí)驗(yàn)同實(shí)施例十。PEMWa累積釋放量與時(shí)間的關(guān)系可以看出，加入模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH 后，其釋放明顯要快于沒加 GSH的樣本，說明載藥交聯(lián)聚合物囊泡在10 mM的GSH的存在下， 能有效釋放藥物。靶向聚合物的PEG分子量比非靶向的PEG要長(zhǎng)，保證靶向分子更好的支出 表面。兩者按不同比例混合可制備表面具有不同靶向分子密度的交聯(lián)聚合物囊泡。優(yōu)選方 案為前者含量為50 wt.9LDLS測(cè)定尺寸為124 nm，粒徑分布較窄。靶向分子能更好的裸露 在外側(cè)，而不是被遮藏在里側(cè)，保證其能更好的發(fā)揮靶向作用，具有更好的靶向效果。
[0034]實(shí)施例十二交聯(lián)聚合物囊泡裝載蛋白藥物及體外釋放 室溫下向950 yL含不同濃度蛋白質(zhì)(FITC標(biāo)記的細(xì)胞色素 C，F(xiàn)ITC-CC)的PB (5 mg/mL) 緩沖溶液中加入50 度為5mg/mL 的PEG5k-P(HPMA9k-LA)-PAA2.4k和Anis-PEG7.5k-P (HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k的DMSO(質(zhì)量I: I)溶液，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)混合液，使之逐漸形成一相。2小 時(shí)分散均勻后，通氮?dú)?0min，加入10%的DTT溶液，37°C恒溫?fù)u床中震蕩（200 rpm)24 h，使 之充分交聯(lián)。然后轉(zhuǎn)入透析袋(Mff⑶：300,000)，室溫下透析24h除去有機(jī)溶劑和游離的蛋 白，透析介質(zhì)為磷酸鹽緩沖溶液(5 mM，pH 7.4)，期間至少換5次介質(zhì)。載不同比例的蛋白 (l%-50wt%)的交聯(lián)聚合物囊泡的粒徑在150-160 nm，粒徑分布在0.12-0.18。得到的囊泡為 FITC-CC-Anis-RCCPs。熒光光譜儀測(cè)定FITC-CC的包裹效率為58%-100% AITC-CC的體外釋 放實(shí)驗(yàn)是在37 °C恒溫?fù)u床中震蕩（200 rpm)進(jìn)行，每組各有三個(gè)平行樣。第一組，載FITC-CC的交聯(lián)聚合物囊泡在加入10 mM GSH模擬細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境PB (10 mM，pH 7.4)中；第二 組，載FITC-CC的交聯(lián)聚合物囊泡在PB (10 mM，pH 7.4)中；載藥交聯(lián)聚合物囊泡的濃度為 100 mg/L，取0.5 mL放入透析袋(MWC0: 30,000 Da)中，每個(gè)試管中加入相應(yīng)的透析介質(zhì) 25 mL，在預(yù)定的時(shí)間間隔，取出5.0 mL透析袋外部介質(zhì)用作測(cè)試，同時(shí)向試管中補(bǔ)加5.0 mL相應(yīng)介質(zhì)。使用熒光儀測(cè)定溶液中藥物濃度。加入10 mM DTT后，F(xiàn)ITC-CC累積釋放量釋 放明顯要快于沒加 DTT的樣本，說明載藥交聯(lián)囊泡在10 mM的DTT的存在下，能有效釋放藥 物。
[0035]實(shí)施例十三靶向交聯(lián)聚合物囊泡載親水藥物DOX'HCl及體外釋放 采用透析法制備囊泡，pH梯度法裝載鹽酸阿霉素（D0X · HCDdO yL的TOG5.0k-P (HPMA7·6k-LA)-PDEA3·Ok的DMF溶液（5 mg/mL)及20 yL的CRGD-PEG6·0k-P(HPMA8·Ok-LA)-TOEA2.6k的DMF溶液(5 mg/mL)均勻混合之后，滴加入0.9毫升的檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖溶液 (10 mM，pH 4.0)中，在37 °C搖床中4小時(shí)后，加入0.05 mL的PB(4M，pH 8.5)建立pH梯度， 隨后立即加入DOX · HCl(10%-30%)，搖床中放置5-10小時(shí);再加入DTT(10.5微克，0.068 μΜ) 使囊泡交聯(lián)。最后裝入透析袋(Mff⑶7000)中對(duì)PB透析過夜，換五次液。載不同比例藥（10-30￥七％)，粒徑80-120 11111，粒徑分布0.10-0.16,0(?.!1(：1的包裹效率為65%-80%。0(^.!1(：1體 外釋放設(shè)計(jì)同實(shí)施例十。加入模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH后，DOX · HCl累積釋放量明顯要快于沒加 GSH的樣本，說明載藥交聯(lián)囊泡在10 mM的GSH的存在下，能有效釋放藥物。
[0036] 更換聚合物以及藥物，可以得到如表2的載藥量、包封率等結(jié)果。
[0037] 表2聚合物囊泡載藥物的載藥量、包封率
實(shí)施例十四MTT法測(cè)試聚合物囊泡的細(xì)胞毒性 MTT法使用人肺癌細(xì)胞(H460、A549)和人成纖維細(xì)胞(L929)。以5\103個(gè)/!1^將細(xì)胞種 于96孔板，每孔100 yL，24小時(shí)后養(yǎng)至細(xì)胞貼壁70%左右。然后，實(shí)驗(yàn)組各孔中分別加入含有 不同濃度(0.1-0.5 mg/mL)的囊泡樣品（以實(shí)施例六的空交聯(lián)聚合物囊泡和實(shí)施例七的空 靶向交聯(lián)聚合物囊泡為例），另設(shè)細(xì)胞空白對(duì)照孔和培養(yǎng)基空白孔(復(fù)4孔）。培養(yǎng)24小時(shí)后， 每孔加入MTT(5.0 mg/mL)10 yL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后每孔加入150 yL DMSO溶解生成的結(jié)晶 子，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)吸光度值(A)，以培養(yǎng)基空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。附圖5為 交聯(lián)聚合物囊泡對(duì)H460的細(xì)胞毒性結(jié)果，可看出，當(dāng)交聯(lián)聚合物囊泡的濃度從0.1增到0.5 mg/mL時(shí)，H460的存活率仍高于90%，說明該交聯(lián)聚合物囊泡具有良好的生物相容性。其他聚 合物囊泡的細(xì)胞毒性的測(cè)定于此類似，毒性均很小，具有良好的生物相容性。
[0038]實(shí)施例十五MTT法測(cè)載藥聚合物囊泡對(duì)H460肺癌細(xì)胞的毒性 測(cè)試對(duì)象為實(shí)施例十的MTX-Anis-RCCPs(MTX'2Na濃度為10 yg/mL，靶向分子含量從 20%、30%、50%到70%，無靶向載藥交聯(lián)聚合物囊泡及游離MTX· 2Na組作為對(duì)照組。細(xì)胞的培養(yǎng) 和實(shí)施例十四相同，共同培養(yǎng)4小時(shí)后，吸出樣品換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育44 h后，而后的 MTT加入、處理和測(cè)定吸光度同實(shí)施例十四。參見附圖6,結(jié)果顯示，50%靶向分子含量具有 最佳的靶向性。用自由藥、無靶向和50%祀向的載藥囊泡做對(duì)H460細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)，MTX· 2Na 濃度范圍為0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10、20和40以8/111^附圖7是載藥交聯(lián)聚合物囊泡對(duì) H460細(xì)胞的毒性，可看出載MTX'2Na的含50% Anis靶向交聯(lián)聚合物囊泡對(duì)H460細(xì)胞的半致 死濃度（IC5q)為2.4 yg/mL，遠(yuǎn)低于自由藥，比無靶向囊泡的半致死濃度小4倍，說明本發(fā)明 的囊泡能很好的將藥物傳送到細(xì)胞內(nèi)，并有效的釋放，最終殺死癌細(xì)胞，而靶向納米粒的效 果要更好。
[0039] 實(shí)施例十六ΜΤΧ-RCCPs和MTX-Anis-RCCPs交聯(lián)囊泡的血液循環(huán) 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心規(guī)定。實(shí)驗(yàn)選用體重為18~20克左右，4 ~6周齡的Balb/C裸鼠。囊泡Anis-RCCPs由PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl ,8k和厶1^8-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k按1:1混合而成，此比例形成的載MTX的交聯(lián)囊泡粒徑 為147納米，粒徑分布為0.19。將載MTX· 2Na的無靶向囊泡ΜΤΧ-RCCPs、靶向囊泡MTX-AniS-RCCPs和Trexall通過尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（MTX藥量為15 mg/kg)，在0、0.25、0.5、1、2、4、8、 12和24小時(shí)定點(diǎn)取血約10 yL，通過差量法準(zhǔn)確計(jì)算血液重量，再加100 yL、l%的曲拉通和 500 yL無水甲醇萃取(含有20 mM的DTT);然后離心（20000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘），取上層清液， 通過高效液相色譜測(cè)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)MTX· 2Na的量。圖8中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為每克血液中 的MTX·2Na占總的MTX·2Na注射量(ID %/g)。由圖可知，Trexalll的循環(huán)時(shí)間很短，2小時(shí)已很 難檢測(cè)到MTX'2Na，而交聯(lián)聚合物囊泡在24小時(shí)后仍有12 ID %/g。靶向載藥交聯(lián)聚合物囊 泡、載藥交聯(lián)聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)的消除半衰期分別為5.24、4.32小時(shí)，而Trexal 1的僅 為0.29小時(shí)，所以靶向載藥交聯(lián)聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定，有較長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。
[0040] 實(shí)施例十七RCCPs-Cy5和Anis-RCCPs-Cy5交聯(lián)囊泡的血液循環(huán) 動(dòng)物同實(shí)施例十七。首先用Cy5-NH2和PEG5k-P (HPMA9. Ok-LA) -PAA2.4k通過酰胺化反 應(yīng)制備Cy5標(biāo)記的聚合物PEG5k-P(HPMA9.0k-LA)-PAA2.4k-Cy5( 1個(gè)Cy5/分子鏈）。囊泡 Αη?8-Κ(ΧΡ8-〇γ5?ΡΕ651?-Ρ(ΗΡΜΑ9·01?-?Α)-ΡΑΑ2·41?-〇75、ΡΕ651?-Ρ(ΗΡΜΑ9·01?-?Α)-ΡΑΑ2 · 4k、和Ani S-PEG7 · 5k-P(ΗΡΜΑ9 · 2k-LA)-ΡΑΑ2 · 4k按1:9:10混合而成，形成的聚合物囊 泡粒徑為160納米，粒徑分布為0.12。將RCCPs-Cy5交聯(lián)囊泡、Anis-RCCPs-Cy5靶向交聯(lián)囊 泡和Anis-RCNCPs-Cy5囊泡通過尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（Cy5濃度為4 μΜ)，在0、0.25、0.5、I、 2、4、8、12和24小時(shí)定點(diǎn)取血約10 yL，通過差量法準(zhǔn)確計(jì)算血液重量，再加如100 yL濃度 為1%的曲拉通和500 yL二甲亞砜萃取(其中含有20 mM的DTT);然后離心（20000轉(zhuǎn)/分鐘， 20分鐘)后，取上層清液，通過熒光光譜儀測(cè)得每個(gè)時(shí)間點(diǎn)Cy5的量。圖9中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱 坐標(biāo)為每克血液中的Cy5占總的Cy5注射量(ID %/g)。由圖可知，Anis-RCNCPs-Cy5的循環(huán)時(shí) 間很短，2小時(shí)已很難檢測(cè)到Cy5,而交聯(lián)聚合物囊泡在24小時(shí)后仍有12 ID %/g。由計(jì)算可 知，靶向交聯(lián)聚合物囊泡、非靶向交聯(lián)聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)的消除半衰期分別為6.32、 6.10小時(shí)，而靶向非交聯(lián)囊的僅為1.61小時(shí)，所以本發(fā)明的交聯(lián)聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)穩(wěn) 定，有較長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。
[0041 ] 實(shí)施例十八ΜΤΧ-RCCPs和MTX-Anis-RCCPs交聯(lián)聚合物囊泡在荷H460肺癌小鼠的 體內(nèi)生物分布 動(dòng)物同實(shí)施例十七，在皮下注射IX IO7個(gè)H460人肺癌細(xì)胞，大約3~4周后，腫瘤大小為 100~200 mm3時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。由PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k和Anis-PEG7.5k-P (HPMAl 2. Ok-LA )-PDMA2.3k 制備 MTX-Ani s-RCCPs 和無靶向交聯(lián)聚合物囊泡 MTX-RCCPs，尾靜 脈注射小鼠體內(nèi)（MTX'2Na:15 mg/kg)，8小時(shí)后處死老鼠，將腫瘤及心，肝，脾，肺和腎組織 取出，清洗稱重后加入500 yL 1%的曲拉通通過勻漿機(jī)磨碎，再加入900 yL無水甲醇萃取 (其中含有20 mM的DTT)。離心（20000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘）后，取上層清液，通過高校液相色譜 測(cè)得每個(gè)時(shí)間點(diǎn)MTX'2Na的量。圖10中橫坐標(biāo)為組織器官，縱坐標(biāo)為每克腫瘤或組織中的 MTX'2Na 占總 MTX'2Na 注射量（IDa/o/gXAnisSO/RCCPsJCCPs 和 Trexall 注射 12 小時(shí)在腫瘤積 累的MTX· 2Na量分別為5 · 3、1 · 2和 0 · 6 ID%/g，MTX-Ani s-RCCPs是MTX-RCCPs和Trexal 1 的 4.5和9倍，說明載藥1^(^1^-1?0^通過主動(dòng)靶向在腫瘤部位積累較多，結(jié)果見表3。
[0042] 實(shí)施例十九Cy5-CC-Ani s-RCCPs和泡Cy5-CC-RCCPs載蛋白交聯(lián)聚合物囊泡在荷 H460肺癌小鼠的體內(nèi)生物分布 生物分布實(shí)驗(yàn)中腫瘤的接種以及尾靜脈給藥同實(shí)施例十八c^SPEGSkKHPMALOk-LA)-PAA2 · 4k/Anis-PEG7 · 5k-P(HPMA9 · 2k-LA)-PAA2 · 4k 制備的載 Cy5 標(biāo)記的 CC(Cy5-CC)的 靶向交聯(lián)聚合物囊泡Cy5-CC-Anis-RCCPs。將Cy5-CC-Anis-RCCPs、非靶向交聯(lián)聚合物囊泡 CC-Cy5_RCCPs和自由蛋白Cy5_CC通過尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（Cy5_CC:0.25 mg equiv./kg)， 8小時(shí)后處死老鼠，將腫瘤及心，肝，脾，肺和腎組織取出，清洗稱重后加入500yLl%的曲拉 通通過勻漿機(jī)磨碎，再加入900yL二甲亞砜萃?。ㄆ渲泻?0mM的DTT)。離心（20000轉(zhuǎn)/分 鐘，20分鐘)后，取上層清液，通過熒光光譜儀測(cè)得每個(gè)時(shí)間點(diǎn)Cy5-CC的量。圖11中橫坐標(biāo)為 組織器官，縱坐標(biāo)為每克腫瘤或組織中的Cy5-CC占總CC-Cy5注射量（ID%/g) XyS-CC-Anis-RCCPs、Cy5-CC-RCCPs和Cy5-CC注射8小時(shí)在腫瘤積累的Cy5-CC量分別為11.5、3.9和2.5 10%/^，075-〇>厶1118-1?〇^8是〇75-〇：-1?〇^8和〇75-〇：的3.0和4.6倍，說明載藥〇75-〇：-Anis-RCCPs通過在腫瘤積累較多，見表3。
[0043] 實(shí)施例二十MTX-Anis-RCCPs和MTX-RCCPs交聯(lián)囊泡在荷H460皮下肺癌的小鼠中 的抑瘤效果、體重變化和存活率 腫瘤的接種以及尾靜脈給藥同實(shí)施例十八，在大約兩周后，腫瘤大小為30~50 mm3時(shí)開 始實(shí)驗(yàn)。由PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k和Anis-PEG7·5k-P(HPMA12·0k-LA)-pDMA2.3k按l:l混合制備的載MTX·2Na的靶向交聯(lián)聚合物囊泡MTX-Anis-RCCPs。將MTX- An i s-RCCPs、MTX-RCCPs、Tr exa 11以及PBS分別在O、3、6、9和12天通過尾靜脈注射小鼠體內(nèi) (MTX· 2Na藥量為15 mg/kg)。在O~21天，每三天稱量小鼠的體重，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，月中 瘤體積計(jì)算方法為:V=(L X WXH)/2，（其中L、W、H分別為腫瘤的長(zhǎng)度、寬度和厚度）。持續(xù)觀 察小鼠的生存到45天。由圖12中可知，MTX-Anis-RCCPs治療組21天時(shí)，腫瘤得到明顯抑制， 而載藥MTX-RCCPs組腫瘤有一定的增長(zhǎng)。Trexall不能抑制腫瘤的增長(zhǎng)，而且其小鼠體重在 15天時(shí)降低了 23%，說明對(duì)小鼠的毒副作用很大。相比之下MTX-Ani s-RCCPs和MTX-RCCPs組 的小鼠體重幾乎沒有改變，說明載藥交聯(lián)聚合物囊泡對(duì)小鼠沒有毒副作用。MTX-Anis-RCCPs治療組在45天后全部存活，Trexall組在31天時(shí)已全部死亡，MTX-RCCPs組在38天時(shí)也 全部死亡。MTX-Anis-RCCPs治療21天的老鼠的主要器官?zèng)]有受到損傷，而Trexall組對(duì)小鼠 的心、肝臟有很大損傷，結(jié)果見表3。
[0044]實(shí)施例二^^一靶向交聯(lián)囊泡GrB-Ani s-RCCPs多次低劑量給藥和單次高劑量給 藥在荷H460皮下肺癌的小鼠中的抑瘤效果、體重變化和存活率 腫瘤的接種以及尾靜脈給藥同實(shí)施例十九。由PEG5k-P(HPMA9.0k-LA9) -PAA2.4k和 Anis-PEG7.5k-P(HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k按l:l混合制備的載GrB的靶向交聯(lián)聚合物囊泡 GrB-Anis-RCCPs(多次給藥）、GrB-Anis-RCCPs(單次給藥）、及PBS分別在0、4、8和12天通過 尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（GrB藥量為50 yg/kg)。在0~21天，每?jī)商旆Q量小鼠的體重，如實(shí)施例 二十測(cè)量腫瘤體積和觀察小鼠到60天。由圖13中可知，GrB-Anis-RCCPs(多次給藥）、GrB-Anis-RCCPs(單次給藥)治療組21天時(shí)，腫瘤得到明顯抑制，而PBS組腫瘤有明顯的增長(zhǎng)。所 有組的小鼠體重幾乎沒有改變，說明載藥交聯(lián)聚合物囊泡對(duì)小鼠沒有毒副作用。PBS組小鼠 在32天全部死亡，而GrB-Anis-RCCPs(多次給藥）、GrB-Anis-RCCPs(單次給藥)治療組能分 別延長(zhǎng)至50天和60天。GrB-Anis-RCCPs治療21天的老鼠的主要器官?zèng)]有受到損傷，而 Trexall組對(duì)小鼠的心、肝臟有很大損傷。因此，本發(fā)明的靶向交聯(lián)聚合物囊泡載藥后可有 效抑制腫瘤的增長(zhǎng)，對(duì)小鼠沒有毒副作用，還可以延長(zhǎng)荷瘤老鼠的生存時(shí)間。
[0045]實(shí)施例二十二靶向交聯(lián)囊泡Epi-cNGQ-RCCPs在荷A549皮下肺癌的小鼠中的抑 瘤效果、體重變化和存活率 A549皮下腫瘤的接種同實(shí)施例十九。由cNGQ-PEG6.0k-P(HPMAl 1.0k-LA)-PAA2.4k/ PEG5k-P(HPMA11.0k-LA)-PAA2.6k按l:l混合制備的載Epi·HCl的靶向交聯(lián)聚合物囊泡 Epi-cNGQ-RCCPs。將Epi-cNGQ-RCCPs、Epi-RCCPs、自由 Epi 以及PBS分別在0、3、6、9和 12天通 過尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（EpiHCl藥量為10 mg/kg)。如實(shí)施例二十、在0~21天內(nèi)稱量小鼠的 體重、量腫瘤體積和觀察小鼠到60天。由結(jié)果可知，Epi-cNGQ-RCCPs治療21天時(shí)，腫瘤得到 明顯抑制，而PBS組腫瘤有明顯的增長(zhǎng)。所有組的小鼠體重幾乎沒有改變，說明載藥交聯(lián)聚 合物囊泡對(duì)小鼠沒有毒副作用。PBS組小鼠在30天全部死亡，而Epi-cNGQ-RCCPs組能延長(zhǎng)壽 命至>60天，并對(duì)老鼠的主要器官?zèng)]有受到損傷，結(jié)果見表3。
[0046] 實(shí)施例二十三靶向交聯(lián)囊泡Epi-cNGQ-RCCPs在荷A549原位肺癌的小鼠中的抑瘤 效果、體重變化和存活率 實(shí)驗(yàn)選用體重為18~20克左右，4~6周齡的Balb/C裸鼠，在肺部直接注射5 X IO6個(gè)帶有 生物發(fā)光的A549人肺癌細(xì)胞(A549-Luc)，大約10天后，通過小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察，老鼠 肺部出現(xiàn)熒光，成功建立A549原位肺癌模型。接著，如實(shí)施例二十二中的藥劑Epi-cNGQ-RCCPs、Epi-RCCPs、自由Epi以及PBS在0、4、8和12天通過尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（Epi · HCl: 10 mg/kg)。從O~16天，每四天稱量小鼠的體重，用小動(dòng)物活體成像儀監(jiān)測(cè)小鼠肺部腫瘤生物發(fā) 光強(qiáng)弱，觀察小鼠的生存到60天。結(jié)果可知，Epi-cNGQ-RCCPs組16天內(nèi)，肺部腫瘤生物發(fā)光 強(qiáng)度持續(xù)減弱，而Epi-RCCPs組肺部的腫瘤生物發(fā)光強(qiáng)度有一定增長(zhǎng)，但兩組體重幾乎沒有 改變。EPi · HCl雖然也能抑制腫瘤的增長(zhǎng)，但小鼠體重在4天時(shí)降低了 15%，說明其對(duì)小鼠的 毒副作用很大。Epi-cNGQ-RCCPs組在60天后仍全部存活，Epi · HCl組在30天時(shí)已全部死亡， PBS組在20天時(shí)也全部死亡。因此，載藥靶向交聯(lián)聚合物囊泡Epi-cNGQ-RCCPs可有效抑制原 位肺癌腫瘤的增長(zhǎng)，對(duì)小鼠沒有毒副作用，并有效延長(zhǎng)荷瘤老鼠的生存時(shí)間。采用類似的實(shí) 驗(yàn)方法研究了多種載不同藥物(MTX·2Na、PEM·Na、GrB、DOX·HCl)的交聯(lián)聚合物囊泡和靶向交 聯(lián)聚合物囊泡對(duì)荷肺癌小鼠的影響，結(jié)果見表3。因此，本發(fā)明的聚合物制備的藥物載體載 藥后可有效抑制肺癌腫瘤增長(zhǎng)，對(duì)小鼠沒有毒副作用，還可以延長(zhǎng)荷瘤老鼠的生存時(shí)間。 [0047]表3載藥交聯(lián)囊泡對(duì)肺癌的體內(nèi)外抗腫瘤結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物，其特征在于，所述側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物的結(jié)構(gòu) 式如下：其中，m 為 68 ~227，x/(x+y) = 0.5 ~1; R1選自以下基團(tuán)中的一種：R2、R3選自以下方案之一： ① R2、R3同為H; ② R2為CH3，R3為Η或者以下基團(tuán)中的一種：P(HPMA-LA)鏈段的分子量是PEG鏈段分子量的3~10倍，ΡΙοη鏈段的分子量是PEG鏈段 分子量的30%~70%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物，其特征在于:所述R1選自以下基團(tuán)中 的一種：所述m為113~170; ΡΙοη鏈段的分子量是PEG鏈段分子量的35%~50%。3. 權(quán)利要求1或者2所述側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 在氮?dú)猸h(huán)境下，氮二羥丙基甲基丙烯酰胺、聚乙二醇化合物和有機(jī)引發(fā)劑溶在有機(jī) 溶劑中；然后于密封反應(yīng)器里，60~70°C反應(yīng)1~3天;然后將反應(yīng)物在冰乙醚中沉淀，再經(jīng) 抽濾并真空干燥濾餅得到PEG-PHPMA; (2) 氮?dú)猸h(huán)境下，將PEG-PHPMA和有機(jī)引發(fā)劑溶在有機(jī)溶劑里，然后加入2-(二甲基氨 基）甲基丙烯酸乙酯；然后于密封反應(yīng)器里，60~70°C反應(yīng)1~3天;然后將反應(yīng)物在冰乙醚 中沉淀，再經(jīng)抽濾并真空干燥濾餅得到PEG-PHPMA-PDMA; (3) 在氮?dú)猸h(huán)境下，硫辛酸溶在有機(jī)溶劑中，配制硫辛酸溶液;將N，N-二環(huán)己基碳二亞 胺于有機(jī)溶劑中，配制N，N-二環(huán)己基碳二亞胺溶液;然后冰水浴下，將N，N-二環(huán)己基碳二亞 胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室溫反應(yīng)10~15小時(shí);反應(yīng)結(jié)束后，過濾反 應(yīng)液，得到硫辛酸酐溶液； (4)氮?dú)猸h(huán)境下，將硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶的有機(jī)溶劑中，密封條 件下，于30°C反應(yīng)1~3天;然后將反應(yīng)物在冰乙醚中沉淀，再經(jīng)抽濾并真空干燥濾餅得到側(cè) 鏈含硫辛?；木酆衔?。4. 一種肺癌特異革E1向的聚合物，其特征在于:所述肺癌特異革E1向的聚合物由權(quán)利要求1 所述側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物鍵合腫瘤特異性靶向分子制備得到。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述肺癌特異祀向的聚合物，其特征在于：所述革E1向分子為Ani s、 cRGD、cNGQ、CC-9 或者 CPP33 多肽分子。6. -種聚合物囊泡，其特征在于，所述聚合物囊泡的制備方法為以下制備方法中的一 種： (1) 由權(quán)利要求1或者2所述側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物制備得到； (2) 由權(quán)利要求4或者5所述肺癌特異靶向的聚合物制備得到； (3) 由權(quán)利要求1或者2所述側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物與權(quán)利要求4或者5所述肺癌特異 靶向的聚合物制備得到； (4) 在權(quán)利要求1或者2所述側(cè)鏈含硫辛?；木酆衔镏苽涞哪遗荼砻媾悸?lián)靶向分子后 得到。7. 權(quán)利要求6所述聚合物囊泡在制備治療肺癌的藥物中應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述治療肺癌的藥物為小分子抗肺癌藥 物、蛋白質(zhì)抗肺癌藥物或者核酸抗肺癌藥物。9. 權(quán)利要求1或者2所述側(cè)鏈含硫辛酰基的聚合物在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求4或5所述肺癌特異靶向的聚合物在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C08F8/34GK105859990SQ201610234759
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月14日
【發(fā)明人】孟鳳華, 楊煒靜, 鐘志遠(yuǎn)
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)