耐熱性β-木糖苷酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種耐熱性0 -木糖巧酶、編碼所述耐熱性0 -木糖巧酶的多核巧酸、 用于表達所述耐熱性0 -木糖巧酶的表達載體、整合了所述表達載體的轉(zhuǎn)化體、W及使用 所述耐熱性0-木糖巧酶制備木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的方法。
[0002] 本申請要求基于2014年12月12日在日本申請的特愿第2014-252069號的優(yōu)先 權(quán)，并在本文中引用其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003] 除了對運輸用能源供應(yīng)的擔(dān)憂之外，由于全球變暖和大氣污染等環(huán)境上的問題， 近年來，石油替代能源的開發(fā)成為非常重要的課題。植物生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生 能源，作為石油替代資源而備受期待。作為植物生物質(zhì)的主要成分的木質(zhì)纖維素為纖維素、 半纖維素（包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖）等多糖類和木質(zhì)素。運些多糖類被各種 糖巧水解酶水解為葡萄糖或木糖等單糖，用作生物燃料或化學(xué)品原料。
[0004] 木質(zhì)纖維素具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，是難分解性的，難W用單一的酶分解、糖化 Oiy化Olyze)。因此，對于多糖類中的纖維素的水解，通常需要糖巧水解酶中的內(nèi)切葡聚糖 酶（內(nèi)切-1，4-0 -D-葡聚糖酶，EC 3. 2. 1. 4)、外切型纖維二糖水解酶（1，4-0 -纖維二糖 糖巧酶（cellobiosidase)或纖維二糖水解酶，EC 3. 2. 1. 91、EC 3. 2. 1. 176)、0 -葡糖巧酶 巧C 3. 2. 1. 21)運=種酶。另一方面，半纖維素的結(jié)構(gòu)因植物的種類而異，例如，在闊葉樹和 草本植物中，木聚糖構(gòu)成了主要成分。對于木聚糖的水解，需要木聚糖酶（內(nèi)切-1,4-0-木 聚糖酶，EC 3. 2. 1. 8)、0 -木糖巧酶巧C3. 2. 1. 37)。0 -木糖巧酶對通過木聚糖酶水解半 纖維素生成的低聚糖進行水解，是設(shè)及單糖生成工藝的水解酶之一。 陽0化]在W往的W木質(zhì)纖維素為資源的生物乙醇的制備中，W乙醇的高能效轉(zhuǎn)化為目 的，嘗試了基于高固液比（30~60%的固液比（solid loading))的糖化處理化y化olysis process)。運種基于高固液比的木質(zhì)纖維素的酶糖化（enzymatic hy化olysis)的生物質(zhì)糖 化液的粘性高化y化olyzed biomass solution),難W進行木質(zhì)纖維素的水解反應(yīng)。因此， 通過使用耐熱性酶在例如80°C W上的高溫下進行酶解糖化處理，除了加快水解反應(yīng)速度之 夕F，降低了生物質(zhì)糖化液的粘性，從而有望實現(xiàn)縮短糖化反應(yīng)時間化y化olysis reaction time)并降低酶量。因此，對于各種糖巧水解酶，期望開發(fā)耐熱性更優(yōu)異的酶。
[0006] 大多數(shù)耐熱性糖巧水解酶可W通過如下方式獲得：對生存于高溫環(huán)境下的嗜熱性 微生物進行分離鑒定，從運些分離培養(yǎng)的微生物中克隆基因，確定DNA序列后，利用大腸桿 菌或絲狀真菌等表達而獲得。例如，專利文獻1公開了來源于絲狀真菌的0-木糖巧酶，專 利文獻2公開了在30°C表現(xiàn)出酶活性的、來源于絲狀真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)的 0-木糖巧酶。專利文獻3中公開了在抑5. 5 W下、50°C W上表現(xiàn)出酶活性的、來源于酸熱 脂環(huán)酸芽抱桿菌（Alixyclobacillus acidocaldarius)的0-木糖巧酶。專利文獻4公開 了在45°C表現(xiàn)出酶活性的、來源于解纖維頂抱霉（Acremonium cellulolyticus)的0-木 糖巧酶。并且，非專利文獻1~6報道了最適溫度為60°C左右的、分離自特定細菌或絲狀 真菌的e-木糖巧酶。另外，非專利文獻7報道了最適溫度為95°c的高耐熱性e-木糖巧 酶。其中，所述酶在W對硝基苯基-P-D-化喃木糖巧（下文中有時縮寫為PNP訝為底物時 的催化效率Kcat/Km極高，為1173. 4mM Is 1，但PNK(的分解活性的半衰期在90°C下約為30 分鐘，熱穩(wěn)定性不充分。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 陽00引專利文獻
[0009] 專利文獻1 :特表平11-507837號公報
[0010] 專利文獻2 :特開平11-313683號公報
[0011] 專利文獻3 :特表2011-523346號公報
[0012] 專利文獻4 :特開2013-59272號公報
[0013] 非專利文獻
[0014] 非專利文獻 1 :Ko;rmelink 等，《Journal of Biotechnology (生物技術(shù)雜志）》， 1993 年，第 27 卷，第 249-265 頁。
[0015] 非專利文獻 2 ,Herrmann 等，《Biochemical Journal (生化雜志）》，1997 年，第 321 卷，第375-381頁。
[0016] 非專利文獻 3 :kitamoto 等，《Applied and !Environmental Microbiology 應(yīng)用 與環(huán)境微生物學(xué)）》，1999年，第65卷，第20-24頁。
[0017] 非專利文獻 4 :La Grange 等，《Applied and !Environmental Microbiology 應(yīng)用 與環(huán)境微生物學(xué)）》，2001年，第67卷，第5512-5519頁。
[0018] 非專利文獻 5 :化ao 等，《Applied and !Environmental Microbiology (應(yīng)用與環(huán) 境微生物學(xué)）》，2011年，第77卷，第719-726頁。
[0019] 非專利文獻 6 :Morais 等，《Journal of Biological Qiemistry(生物化學(xué)雜 志）》，2012年，第287卷，第9213-9221頁。
[0020] 非專利文獻7 :Shi等，《Biotechnology for Biofuels(生物燃料技術(shù)）》，2013年， 第6卷，第27期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題 陽02引本發(fā)明的目的是提供一種至少在105°C且抑5. 0的條件下表現(xiàn)出W PNPX為底物的 水解活性的新耐熱性P-木糖巧酶、編碼所述耐熱性P-木糖巧酶的多核巧酸、用于表達所 述耐熱性0 -木糖巧酶的表達載體、整合了所述表達載體的轉(zhuǎn)化體、W及使用所述耐熱性 0-木糖巧酶制備木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的方法。
[0023] 解決技術(shù)問題的技術(shù)手段
[0024] 本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題，通過從溫泉高溫±壤中直接提取DNA來進行 難培養(yǎng)微生物群的大規(guī)模宏基因組測序，成功獲取了具有新的氨基酸序列的耐熱性0 -木 糖巧酶，從而完成了本發(fā)明。
[00巧]目P，作為本發(fā)明的耐熱性0-木糖巧酶、多核巧酸、表達載體、轉(zhuǎn)化體、耐熱性 0 -木糖巧酶的制備方法、糖巧水解酶混合物、W及木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制備方法，可W 列舉下列[1]~[10]的實施方案。
[0026] 山一種耐熱性e -木糖巧酶，其具有由下列（A)、做或似構(gòu)成的e -木糖巧 酶催化區(qū)域：
[0027] (A)由序列號1或2所示氨基酸序列構(gòu)成的多膚；
[0028] 度）由序列號1或2所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或添加而形 成的氨基酸序列所構(gòu)成、并且至少在l〇5°C且抑5. 0的條件下具有W對硝基苯基-0 -D-化 喃木糖巧為底物的水解活性的多膚；
[0029] 似由與序列號1或2所示氨基酸序列具有75% W上序列一致性的氨基酸序列所 構(gòu)成、并且至少在105°C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯基-0 -D-化喃木糖巧為底物的 水解活性的多膚。
[0030] 凹上述山的耐熱性0 -木糖巧酶，其還進一步具有選自由a A-阿拉伯巧喃糖 巧酶活性和〇寸-阿拉伯化喃糖巧酶（日1'油；[]10口7拘]1031(1日36)活性構(gòu)成的組中的至少一種 活性。
[00川 閒一種多核巧酸，其具有由下列（a)~（e)中堿基序列構(gòu)成的編碼0 -木糖巧酶 催化區(qū)域的區(qū)域：
[0032] (a)編碼由序列號1或2所示氨基酸序列構(gòu)成的多膚的堿基序列；
[0033] 化）編碼由序列號1或2所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或添 加而形成的氨基酸序列所構(gòu)成的、并且至少在105°C且抑5. 0的條件下具有W對硝基苯 基-0 -D-化喃木糖巧為底物的水解活性的多膚的堿基序列；
[0034] (C)編碼由與序列號1或2所示氨基酸序列具有75% W上序列一致性的氨基酸序 列所構(gòu)成的、并且至少在l〇5°C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯基-0 -D-化喃木糖巧為 底物的水解活性的多膚的堿基序列；
[0035] (d)與序列號3或4所示堿基序列具有80% W上序列一致性、并且編碼至少在 105°C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯基-0 -D-化喃木糖巧為底物的水解活性的多膚的 堿基序列；
[0036] (e)與由序列號3或4所示堿基序列構(gòu)成的多核巧酸在嚴格條件下進行雜交的多 核巧酸的堿基序列、且編碼至少在105°C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯基-0 -D-化喃 木糖巧為底物的水解活性的多膚的堿基序列。
[0037] [4]上述[3]的多核巧酸，所述多膚還進一步具有選自由a A-阿拉伯巧喃糖巧酶 活性和a A-阿拉伯化喃糖巧酶活性構(gòu)成的組中的至少一種活性。
[0038] [引一種表達載體，其整合了上述[3]或[4]的多核巧酸，在宿主細胞中可表達具 有0-木糖巧酶活性的多膚。
[0039] [6] -種轉(zhuǎn)化體，其導(dǎo)入有上述閒的表達載體。
[0040] [7]上述[6]的轉(zhuǎn)化體，其為真核微生物。
[0041] [引上述耐熱性0 -木糖巧酶的制備方法，其包括在上述[6]或[7]的轉(zhuǎn)化體中生 產(chǎn)上述耐熱性P-木糖巧酶。 陽0創(chuàng) [9] 一種糖巧水解酶混合物，其包含上述山或凹的耐熱性0-木糖巧酶、上述
[3]或[4]的多核巧酸編碼的耐熱性0-木糖巧酶、或者利用上述[引的耐熱性0-木糖巧 酶的制備方法制得的耐熱性P -木糖巧酶、W及至少一種其他糖巧水解酶。
[0043] [10] -種木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制備方法，其包括使由木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料 與上述[1]或[2]的耐熱性e -木糖巧酶、上述[3]或[4]的多核巧酸編碼的耐熱性e -木 糖巧酶、上述[6]或上述[7]中記載的轉(zhuǎn)化體、利用上述[引的耐熱性0-木糖巧酶的制備 方法制得的耐熱性0 -木糖巧酶、或者上述[9]的糖巧水解酶混合物接觸，由此生產(chǎn)木質(zhì)纖 維素分解產(chǎn)物。 W44] 發(fā)明效果 W45] 本發(fā)明的耐熱性0 -木糖巧酶至少在105°C且抑5. O的條件下具有W PNPX為底物 的水解活性。因此，上述耐熱性P-木糖巧酶適合于高溫條件下的、由木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的 材料的糖化處理化y^olysis process)。
[0046] 此外，作為另一方面，上述耐熱性0-木糖巧酶適合于高溫條件下的、包含具有 0-木糖巧鍵的化合物的材料的糖化處理。另外，所述包含具有0-木糖巧鍵的化合物的材 料例如可W通過用木聚糖酶對包含半纖維素的木質(zhì)纖維素所構(gòu)成的材料進行水解而獲得。
[0047] 此外，作為又一方面，上述耐熱性0-木糖巧酶適合于高溫條件下的、包含阿拉 伯糖殘基、更具體而言包含阿拉伯巧喃糖殘基或阿拉伯化喃糖殘基的材料的糖化處理 (hydrolysis process)。
[0048] 此外，本發(fā)明的多核巧酸、整合了所述多核巧酸的表達載體、導(dǎo)入有所述表達載體 的轉(zhuǎn)化體適合用于制備本發(fā)明的耐熱性0-木糖巧酶。
【附圖說明】 W例圖IA為開放閱讀框0J1M-273的堿基序列（序列號如與0 -木糖巧酶候選基因 0J1M-273-1的堿基序列（序列號4)的比對圖（前半部分）。
[0050] 圖IB為開放閱讀框0J1M-273的堿基序列（序列號3)與0 -木糖巧酶候補基因 0J1M-273-1的堿基序列（序列號4)的比對圖（后半部分，圖IA的延續(xù)）。
[0051] 圖2為開放閱讀框0J1M-273的氨基酸序列（序列號1)與0 -木糖巧酶候選基因 0J1M-273-1的氨基酸序列（序列號2)的比對圖。 陽05引圖3為0 -木糖巧酶候選基因0J1M-273-1的氨基酸序列（序列號2)與 Candida1:us Caldatribacteirum californiense 的 0-木糖巧酶（序列號 9)的比對圖。 [0053] 圖4為表示實施例1中的0J1M-273-1基因在大腸桿菌中表達得到的0J1M-27