％的654溶液。在整個測算過程中，添加50mM化is-HCl緩沖液 (P冊.0)替代基因重組大腸桿菌破碎上清液或純化酶，將W相同條件反應的混合液作為對 照區(qū)。此外，酶（基因重組大腸桿菌破碎上清液或純化酶）與純化水與緩沖液的混合液在 反應溫度下保溫5分鐘后（預溫育），添加底物溶液，開始反應。10分鐘的反應結束后，向 各混合液添加等量的0. 2M胞2〇)3溶液并進行攬拌，使反應停止，然后進行5分鐘離屯、處理， 得到上清液。上清液中的對硝基苯酪含量是用分光光度計測算420nm的吸光度，使用預先 制作的對硝基苯酪含量與420nm吸光度的校準曲線進行計算，由與對照區(qū)的差求得通過酶 的水解生成的對硝基苯酪含量。W 1分鐘生成1 y mol對硝基苯酪的酶活性為1U，除W蛋白 質質量得到的值為比活性扣/mg)。此外，各個測算通過3次獨立的試驗進行，求得平均值和 標準誤差（St曰nd曰rd errors)。 陽187] 其結果為，在使用基因重組大腸桿菌破碎上清液時和使用純化酶時，確認到他們 兩者都具有P -木糖巧酶活性（PNK(水解活性）。
[0188] <8〉0JlM-273-l 的底物特異性
[0189] 對于0J1M-273-1基因編碼的酶蛋白（0J1M-273-1)，研究了其相對于各種纖維素 底物及半纖維素底物的水解活性。作為底物，使用了 CMC(Sigma社制）、木聚糖（來源于樣 木，Sigma社制）、阿拉伯聚糖（來源于甜菜，Sigma社制）、阿拉伯半乳聚糖（來源于落葉松、 Sigma 社制）、PNPX (Sigma 社制）、PNPG (Sigma 社制）、PNPAF (Sigma 社制）、PNPAP (Sigma 社 審Ij )、PNPGA (Sigma 社制）、PNPFP (Sigma 社制）、PNPRP (Sigma 社制）、PNPMP (Sigma 社制）、 PNPadX (Sigma 社制）、W及 PNPbdFP (Sigma 社制）。 陽190] 具體而言，WCMC、木聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖W外的底物（PNP底物）為 底物時，除了使用稀釋為0. 〇2mg/mL的純化酶與20mM的各底物水溶液在105°C反應之外， W與上述<7〉相同的方式進行，求取通過酶的水解生成的對硝基苯酪含量，算得比活性扣/ mg)。
[0191] W CMC、木聚糖、阿拉伯聚糖或阿拉伯半乳聚糖為底物時，除了使用稀釋為 0. 02mg/mL的純化酶與1質量％的各底物水溶液在105°C反應之外，W與上述<7〉相同的方 式反應，反應結束后，添加等量的3, 5-二硝基水楊酸試劑值NS溶液）在100°C進行5分鐘 熱處理，冰上冷卻5分鐘后，在室溫下，W 17, 500g進行5分鐘的離屯、分離處理，得到上清 液。上清液中的還原糖含量W如下方式求得，用分光光度計測算上清液在540nm的吸光度， 使用由葡萄糖制作的校準曲線（W木聚糖為底物時為由木糖制作的校準曲線，W阿拉伯聚 糖、阿拉伯半乳聚糖為底物時為由阿拉伯糖制作的校準曲線）進行計算，由與對照區(qū)的差 求得通過酶的水解生成的還原糖含量。W 1分鐘生成1 y mol還原糖（Re化ced Sugar)的 酶活性為1U，除W蛋白質質量得到的值為比活性扣/mg)。 陽192] 測定結果示于圖5中。酶活性表示為W相對于PWX的水解活性為100%的相對值 巧elative activity, % )。其結果為，0J1M-273-1 表現(xiàn)出對于 PNPX、PNPAF、PNPAP、阿拉 伯聚糖、W及阿拉伯半乳聚糖的高水解活性，對于PNPG與木聚糖也表現(xiàn)出了弱分解活性， 但對于其他底物，幾乎沒有表現(xiàn)出水解活性。 陽19引 <9〉0JlM-273-l的0-木糖巧酶的動力學化inetics) 陽194] 對0J1M-273-1的PNP底物水解的最大初速度（Vmax)、米氏常數(shù)（Km)及催化效 率化cat/Km)進行了研究。動力學的測定，除了將PNra水溶液的濃度設為0. 2mM、0. 5mM、 ImM、3mM、5mM、IOmM或20mM，將PNPAF水溶液及PNPAP水溶液的濃度分別設為ImM、3mM、5mM、 10mM、20mM、30mM、40mM、50mM或60mM，使用稀釋為0.0 lmg/血的酶在105°C使他們反應之外， W與上述<7〉相同的方式進行，算得PNP底物水解活性扣/mg)。最大初速度（Vmax)和米氏 常數(shù)（Km)是通過使用數(shù)據(jù)分析軟件化igin化i曲t Stone社制）進行米-曼式模型擬合求 得的，由所得數(shù)值算得催化效率化cat/Km)。
[0195] 結果示于表2中。最大初速度在底物為PNPAF時最大，但催化效率在底物為PNPX 時最大。運表示PNPX為最適合于0J1M-273-1的底物。 陽196][表引 陽1巧1
[0198] <10〉W PNPX為底物的0 -木糖巧酶活性的抑及溫度依賴性
[0199] 對0J1M-273-1基因編碼的酶蛋白（0J1M-273-1)的PNra水解活性的溫度依賴性 及抑依賴性進行了研究。測算中使用了將上述<6〉中得到的純化酶稀釋為0.1 mg/血而得 到的純化酶溶液。 陽200] 純化的0J1M-273-1的PNra水解活性的溫度依賴性的測定除了使反應溫度為60、 70、80、90、95、100、105、110或115°(：來進行之外，^與上述<7〉相同的方式進行，求得因酶 的水解生成的對硝基苯酪含量，算出PNra水解活性扣/mg)。 陽201] 結果示于圖6中。酶活性表示為W表現(xiàn)出最高水解活性的105°C的值為100%的相 對值巧elative activity, % )。0J1M-273-1在溫度范圍60~110°C內表現(xiàn)出對于PNPX 水解活性（圖6)。在60~105°C的范圍內，在酶反應溫度上升的同時，PWX水解活性也上 升，表現(xiàn)出最高活性的最適溫度燈。Pt)為105°C。將酶反應溫度設為105°C W上時，PNK(水 解活性急劇下降。 陽20引純化的0J1M-273-1的PNPX水解活性的抑依賴性的測定除了使用稀釋為0. lmg/ 血的純化酶溶液和150 y L McIlvaine緩沖液（P冊~8)在105°C反應之外，W與上述<7〉 相同的方式進行，求得因酶的水解生成的對硝基苯酪含量，算出PNra水解活性扣/mg)。 陽203] 結果示于圖7中。酶活性表示為W表現(xiàn)出最高水解活性的抑5. 0的值為100% 的相對值巧elative activity, %)。抑標繪了底物、緩沖液和酶的混合液的測量值。 0J1M-273-1在抑4. 5~7的范圍內表現(xiàn)出PNra水解活性。最適抑為5. 14 (底物、緩沖液 和酶的混合液的測量值）。 陽204] <11〉0 -木糖巧酶的熱穩(wěn)定性測定
[0205] 對0J1M-273-1的PNPX水解活性的熱穩(wěn)定性進行了研究。測算中使用了將上述 <6〉中得到的純化酶稀釋為0.1 mg/血而得到的純化酶溶液。 陽206] 具體而言，將由6 y L純化酶溶液（0.1 mg/mL)、294 y L純化水、150 y L 200mM的醋 酸緩沖液（9冊.0)構成的混合液在85°(：、90°(：、95°(：、100°(：或105°(：的各溫度下保溫（預溫 育）0、30、60、120或240分鐘后，W與上述<7〉相同的方式進行，在95°C下測定PWX水解活 性，求得因酶的水解生成的對硝基苯酪含量，算出比活性扣/mg)。
[0207] 結果示于圖8中。酶活性表示為W非處理區(qū)（保溫時間0分鐘）的活性為100% 的相對值巧elative activity，％)。W酶活性降為非處理區(qū)的50%的保溫時間為半衰期 Thgif。0J1M-273-1的Thgif在保溫溫度為85°C時為約240分鐘，在90°C及95°C時為約180分 鐘，在100°C時為約130分鐘。另一方面，將保溫溫度設為105°C時，PNK(水解活性急劇下 降，30分鐘即降至約30%。
【主權項】
1. 一種耐熱性β-木糖苷酶，其具有由下列（A)、（B)或（C)構成的β-木糖苷酶催化 區(qū)域： (Α)由序列號1或2所示氨基酸序列構成的多肽； (Β)由序列號1或2所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或添加而形成的 氨基酸序列所構成、并且至少在l〇5°C且ρΗ5. 0的條件下具有以對硝基苯基-β -D-吡喃木 糖苷為底物的水解活性的多肽； (C)由與序列號1或2所示氨基酸序列具有75%以上序列一致性的氨基酸序列所構 成、并且至少在105°C且ρΗ5. 0的條件下具有以對硝基苯基- β -D-吡喃木糖苷為底物的水 解活性的多肽。2. 根據(jù)權利要求1所述的耐熱性β -木糖苷酶，其還進一步具有選自由a -L-阿拉伯 呋喃糖苷酶活性及a -L-阿拉伯吡喃糖苷酶活性構成的組中的至少一種活性。3. -種多核苷酸，其具有由下列（a)~（e)中堿基序列構成的編碼β-木糖苷酶催化 區(qū)域的區(qū)域： (a) 編碼由序列號1或2所示氨基酸序列構成的多肽的堿基序列； (b) 編碼由序列號1或2所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或添 加而形成的氨基酸序列所構成的、并且至少在105°C且pH5. 0的條件下具有以對硝基苯 基- β -D-吡喃木糖苷為底物的水解活性的多肽的堿基序列； (c) 編碼由與序列號1或2所示氨基酸序列具有75%以上序列一致性的氨基酸序列所 構成的、并且至少在105°C且ρΗ5. 0的條件下具有以對硝基苯基- β -D-吡喃木糖苷為底物 的水解活性的多妝的喊基序列； (d) 與序列號3或4所示堿基序列具有80%以上序列一致性、并且編碼至少在105°C 且PH5. 0的條件下具有以對硝基苯基- β -D-吡喃木糖苷為底物的水解活性的多肽的堿基 序列； (e) 與由序列號3或4所示堿基序列構成的多核苷酸在嚴格條件下進行雜交的多核苷 酸的堿基序列、且編碼至少在105°C且pH5. 0的條件下具有以對硝基苯基- β -D-吡喃木糖 苷為底物的水解活性的多肽的堿基序列。4. 根據(jù)權利要求3所述的多核苷酸，所述多肽還進一步具有選自由a -L-阿拉伯呋喃 糖苷酶活性及a -L-阿拉伯吡喃糖苷酶活性構成的組中的至少一種活性。5. -種表達載體，其整合了根據(jù)權利要求3或4所述的多核苷酸，在宿主細胞中可表達 具有木糖苷酶活性的多肽。6. -種轉化體，其導入有根據(jù)權利要求5所述的表達載體。7. 根據(jù)權利要求6所述的轉化體，其為真核微生物。8. -種耐熱性β -木糖苷酶的制備方法，其包括在根據(jù)權利要求6或7所述的轉化體 中生產(chǎn)耐熱性β-木糖苷酶。9. 一種糖苷水解酶混合物，其包含根據(jù)權利要求1或2所述的耐熱性β -木糖苷酶、 根據(jù)權利要求3或4所述的多核苷酸編碼的耐熱性β -木糖苷酶、或者利用根據(jù)權利要求8 所述的耐熱性β-木糖苷酶的制備方法制得的耐熱性β -木糖苷酶、以及至少一種其他糖 苷水解酶。10. -種木質纖維素分解產(chǎn)物的制備方法，其包括使木質纖維素所構成的材料與根據(jù) 權利要求1或2所述的耐熱性β -木糖苷酶、根據(jù)權利要求3或4所述的多核苷酸編碼的 耐熱性β -木糖苷酶、根據(jù)權利要求6或7所述的轉化體、利用根據(jù)權利要求8所述的耐熱 性β-木糖苷酶的制備方法制得的耐熱性β-木糖苷酶、或者根據(jù)權利要求9所述的糖苷 水解酶混合物接觸，由此生產(chǎn)木質纖維素分解產(chǎn)物。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種耐熱性β-木糖苷酶，其具有由下列(A)、(B)或(C)構成的β-木糖苷酶催化區(qū)域：(A)由序列號1或2所示氨基酸序列構成的多肽；(B)由序列號1或2所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所構成、并且至少在105℃且pH5.0的條件下具有以對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷為底物的水解活性的多肽；(C)由與序列號1或2所示氨基酸序列具有75％以上序列一致性的氨基酸序列所構成、并且至少在105℃且pH5.0的條件下具有以對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷為底物的水解活性的多肽。
【IPC分類】C12P19/04, C12N9/42, C12N1/19, C12N15/56, C12N1/21, C12N15/63, C12N1/15, C12P19/14, C12N5/10
【公開號】CN105695436
【申請?zhí)枴緾N201510895691
【發(fā)明人】大熊二郎, 須田汀, 山口明日香, 廣瀨佳嗣, 近藤康弘, 佐藤大, 柴田大輔
【申請人】本田技研工業(yè)株式會社
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2015年12月8日
【公告號】EP3031912A1, US20160168548