用于生物合成異丁烯酸鹽的方法
【專利說明】用于生物合成異T稀酸鹽的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于生物合成異下締酸鹽的方法，且更具體而言設(shè)及使用一種或多種 分離的酶(諸如一種或多種硫醋酶、脫氨酶或轉(zhuǎn)移酶)或使用表達(dá)一種或多種此類酶的重組 宿主細(xì)胞合成異下締酸鹽。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 異下締酸鹽(methac巧late)(2-甲基丙締酸)是一種廣泛用于異下締酸醋，諸如異 下締酸甲醋或聚（異下締酸甲醋）（其用于生產(chǎn)透明的聚異下締酸甲醋丙締酸塑料）的中間 體。異下締酸鹽可W通過各種路徑合成，包括通過使用硫酸將丙酬合氯化氨（acetone cyanohydrin)轉(zhuǎn)化為硫酸甲基丙締酷胺W及水解成異下締酸，通過將異下締氧化為異下締 醒(其被氧化為異下締酸），或者通過異下酸的脫氨。參見例如Bauer, "Methacrylic Acid and Derivatives，'in Ullmann'S Encyclopedia of Industrial Chemistry 2002 ,Wiley-VCH，Weinheim。因而，需要用于生成異下締酸鹽的生物合成方法W避免使用危險(xiǎn)的化學(xué)品。
[0004] 發(fā)明概述
[0005] 本公開內(nèi)容至少部分基于用于生物合成異下締酸鹽的酶促系統(tǒng)和重組宿主的開 發(fā)，所述異下締酸鹽是一種可用于生產(chǎn)異下締酸醋或聚（異下締酸甲醋）醋類，諸如異下締 酸甲醋或聚（異下締酸甲醋）的中間體。特別地，如本文中描述的，可W自可再生給料生物合 成生成異下締酸鹽。異下締酸鹽的生成經(jīng)由異下酷基CoA進(jìn)行。術(shù)語"異下締酸鹽"和"異下 締酸"在本文中可互換使用，指任何其中性或離子化形式的相同化合物，包括其任何鹽形 式。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解具體的形式會(huì)取決于pH。
[0006] 在一個(gè)方面，本文件特征在于生成異下締酸鹽的方法。該方法包括從丙酬酸酶促 合成異下締酷基-CoA,并且使用硫醋酶或CoA-轉(zhuǎn)移酶將異下締酷基-CoA酶促轉(zhuǎn)化為異下締 酸鹽。硫醋酶可W在EC 3.1.2.-下分類，并且可W是tesB或化iA的基因產(chǎn)物。CoA-轉(zhuǎn)移酶可 ^在6〔2.8.3.-下分類，并且可^具有66油3證登錄號〔4877207.1(沈9 10^:4)。
[0007] 本文件的特征還在于生成異下締酸鹽的方法。該方法包括自丙酬酸酶促合成異下 醒，并且將異下醒酶促轉(zhuǎn)化為異下締酸鹽?？蒞使用苯乙醒脫氨酶、異下醒脫氨酶或乳醒脫 氨酶將異下醒轉(zhuǎn)化為異下酸，可W使用CoA轉(zhuǎn)移酶或連接酶將異下酸轉(zhuǎn)化為異下酷基-CoA, 可W使用脫氨酶將異下酷基-CoA轉(zhuǎn)化為異下締酷基-CoA,并且可W使用硫醋酶或CoA轉(zhuǎn)移 酶將異下締酷基-CoA轉(zhuǎn)化為異下締酸鹽。苯乙醒脫氨酶可W在EC 1.2.1.39下分類。例如， 苯乙醒脫氨酶可W與SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。乳醒脫 氨酶可W在EC 1.2.1.22下分類。異下醒脫氨酶可W與SEQ ID N0:6中所列的氨基酸序列具 有至少70%序列同一性。CoA轉(zhuǎn)移酶可W是EC 2.8.3.1下分類的丙酸CoA轉(zhuǎn)移酶。例如，丙酸 CoA-轉(zhuǎn)移酶可W與SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5.的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。 連接酶可W是EC 6.2.1.13下分類的丙酸CoA連接酶。
[000引在一個(gè)方面，本文件特征在于生成異下締酸鹽的方法。該方法包括使用硫醋酶或 CoA-轉(zhuǎn)移酶將異下締酷基-CoA酶促轉(zhuǎn)化為異下締酸鹽。硫醋酶可W在EC 3.1.2.-下分類。 例如，硫醋酶可W是tesB或YciA的基因產(chǎn)物。硫醋酶可W與SEQ ID NO: 1、2或3的氨基酸序 列具有至少70 %序列同一性。Co A-轉(zhuǎn)移酶可W在EC 2.8.3.-下分類。例如，Co A-轉(zhuǎn)移酶可W 與SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5.的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。可W從丙酬酸酶 促合成異下締酷基-CoA。例如，可W使用例如一種或多種下述酶，自丙酬酸經(jīng)由異下醒酶促 合成異下締酷基-CoA:乙酷乳酸合酶;二徑基異戊酸脫氨酶;2，3-二徑基異戊酸脫水酶;2-氧代戊酸脫酸酶;苯乙醒脫氨酶，異下醒脫氨酶或乳醒脫氨酶;或CoA轉(zhuǎn)移酶或連接酶;或酷 基-CoA脫氨酶。也可W使用例如一種或多種下述酶，經(jīng)由2-氧代-異戊酸至異下酷基-CoA的 轉(zhuǎn)化自丙酬酸酶促合成異下締酷基-CoA:乙酷乳酸合酶;二徑基異戊酸脫氨酶;2，3-二徑基 異戊酸脫水酶;支鏈脫氨酶;或酷基-CoA脫氨酶。連接酶可W是EC 6.2.1.13下分類的丙酸 CoA連接酶?？峄?CoA脫氨酶可W是異下酷基-CoA脫氨酶，例如，與SEQ ID N0:7或SEQ ID NO: 9中所列的氨基酸序列具有至少70 %序列同一性的異下酷基-CoA脫氨酶。
[0009] 本文中描述的任何方法可W在重組宿主(例如原核生物或真核生物）中進(jìn)行。宿主 可W經(jīng)受厭氧、需氧或微需氧培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)策略?？蒞經(jīng)由氮、憐酸鹽或氧限制在營養(yǎng) 物限制的條件下培養(yǎng)所述宿主?？蒞使用陶瓷中空纖維膜保留所述重組宿主細(xì)胞W在發(fā)酵 期間維持高細(xì)胞密度。補(bǔ)料到發(fā)酵的主要碳源可W源自生物或非生物給料。生物給料可W 是或可W源自單糖，二糖，木質(zhì)纖維素、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素諸如乙酷丙酸和慷醒、木 質(zhì)素、甘油=醋例如甘油和脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢物或城市廢物。非生物給料可W是或可W源自天 然氣、合成氣、0)2/此，甲醇，乙醇，非揮發(fā)性殘留物(NVR)或來自環(huán)己燒氧化過程的堿洗液 (caustic wash)。
[0010] 在本文中描述的任何方法中，可W經(jīng)由在選擇性環(huán)境中的連續(xù)培養(yǎng)改善所述宿主 對高濃度的異下締酸的耐受性。
[0011] 在本文中描述的任何方法中，可W在所述宿主中減弱導(dǎo)致并且包含異下締酸的中 屯、代謝物和中屯、前體的內(nèi)源降解途徑。
[0012] 在本文中描述的任何方法中，可W通過遺傳工程化改造對細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)修飾或者 提高異下締酸的任何關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增強(qiáng)或放大異下締酸穿過細(xì)胞膜到胞外介質(zhì)的流 出。
[0013] 本文件的特征還在于重組宿主，其包含至少一種編碼苯乙醒脫氨酶的外源核酸， 其中所述重組宿主生成異下締酸。苯乙醒脫氨酶可W在EC 1.2.1.39下分類。宿主可W進(jìn)一 步包含編碼丙酸CoA轉(zhuǎn)移酶的外源核酸。宿主可W進(jìn)一步包含編碼丙酸CoA連接酶的外源核 酸。宿主可W進(jìn)一步包含編碼化iA或tesB的基因產(chǎn)物的外源核酸。
[0014] 本文件的特征還在于重組宿主，其包含至少一種編碼苯乙醒脫氨酶的外源核酸， 其中重組宿主生成異下締酸。苯乙醒脫氨酶可W在EC 1.2.1.39下分類。例如，苯乙醒脫氨 酶可W與SEQ ID NO:8中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。宿主可W進(jìn)一步包 含下述外源酶中的一種或多種(例如1、2、3、或4):丙酸CoA轉(zhuǎn)移酶、丙酸CoA連接酶、硫醋酶 和異下酷基-CoA脫氨酶。丙酸CoA轉(zhuǎn)移酶可W與SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 5的氨基酸序列 具有至少70%序列同一性。硫醋酶可W是YciA或tesB的基因產(chǎn)物。硫醋酶可W與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2或沈Q ID N0:3的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。異下酷基-CoA 脫氨酶可W與SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:9中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。
[0015] 任何重組宿主或任何方法中使用的任何重組宿主可W是原核生物。原核生物可W 來自埃希氏菌屬（Escherichia)如大腸桿菌（Escherichia coli);來自梭菌屬 (Clostridia)如楊氏梭菌（Clostridium I jungdahlii)、自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)或者克魯佛梭菌（Clostridium kluyveri);來自棒狀桿菌屬 (Corynebacteria)如谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum);來自貪銅菌屬 (C叫riavidus)如鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator)或者耐金屬貪銅菌（Cupriavidus metallidurans);來自假單胞菌屬（Pseudomonas )如巧光假單胞菌（Pseudomonas f Iuorescens)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)或者食油假單胞菌（Pseudomonas oleavorans);來自代爾夫特菌屬(Delftia)，食酸代爾夫特菌（Delftia acidovorans);來 自芽抱桿菌屬（Bacillus)如枯草芽胞桿菌（Bacillus subtillis);來自乳桿菌屬 化actobacilIus)如德氏乳桿菌化actobacillus deIbrueckii );或者來自乳球菌屬 (Lactococcus)如乳酸乳球菌(Xactococcus Iactis)或來自紅球菌屬（I^iodococcus)如馬 紅球菌（I^hodococcus equi)。
[0016] 任何重組宿主或任何方法中使用的任何重組宿主可W是真核生物。所述真核生物 可W來自曲霉屬（Aspergillus)如黑曲霉（Aspergillus niger);來自酵母屬 (Saccharomyces)如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);來自畢赤氏酵屬（Pichia)如 己斯德畢赤酵母(Pichia pastoris);來自耶羅維亞酵母屬(