自切膠純化的 基因片段產(chǎn)物3yl，pMD 18-T Vector 2yl，Ligation Solution I 5yl?；靹蚝髮㈦x心管置 于16°C干式恒溫器中，連接時間設(shè)置為2h。然后，將連接產(chǎn)物全量加入到感受態(tài)細胞中，混 勻，冰上放置30min，然后42°C熱休克90s，注意不要搖動，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷 卻2min，立即加入事先預(yù)熱到37°C無抗生素的800yL LB培養(yǎng)基，37°C空氣搖床溫和振蕩培 養(yǎng)lh，培養(yǎng)物瞬時離心，取200yL上清液，均勻涂布于含50yg/mLAmp+的LB平板上，待液體被 吸收后倒置平板，37°C溫箱中過夜培養(yǎng)。
[0048] 6、重組質(zhì)粒的鑒定
[0049] AIT-pMD18T和TRAP-pMD18T重組質(zhì)粒按下列體系進行雙酶切鑒定(重組質(zhì)粒30yl， lOXBuffer 5yl，BamH I 2.5yl，Hind III 2.5yl，ddH20總體系50yl)。混勻后37°C水浴3h。 取重組質(zhì)粒0.5yl作為模板，其余試劑、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件分別參照1.5中各自目的PCR擴 增體系。取5iU上樣，于1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。結(jié)果如圖3所示，均在預(yù)期位置出現(xiàn)目的基 因條帶及載體片段條帶，將鑒定正確的質(zhì)粒作為模板，通過設(shè)計的引物進行PCR驗證，1%瓊 脂凝膠電泳結(jié)果出現(xiàn)目的條帶且與雙酶切后目的基因大小一致。將鑒定正確的陽性菌株送 北京金偉智公司進行基因測序，將測序結(jié)果用BLSAT方法與GenBank中已發(fā)表的標準序列進 行比較，測序結(jié)果與NCBI上金黃色葡萄球菌TRAP序列及實驗設(shè)計的序列進行比對，同源性 達到100 %。
[0050] 7、eAls蛋白原核克隆載體構(gòu)建
[0051] 獲取發(fā)表的Als3T細胞表位序列，設(shè)計一段序列將這個Als3T細胞表位序列重復(fù)6 次，每兩個Als3T細胞表位序列之間加一段柔性Linker(GSGSGSGS)且在第一個Als3T細胞表 位序列的5 '端及最后一個A1 s3T細胞表位序列的3 '端各加上一段同樣的Linker便于表達， 該片段表達產(chǎn)物稱為eAls。在這段序列的5'添加BamH I限制性內(nèi)切酶位點，3'端添加Hind III限制性內(nèi)切酶位點。將這段序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并連接到 PUC57載體上。
[0052] 8、重組蛋白原核表達載體構(gòu)建
[0053] 將pET-28a質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind m進行雙酶切，用DNA純化/回 收試劑盒進行回收。同時將重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-AIT、pMD-18T-TRAP及pUC57-eAls分別用 限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind m進行雙酶切，用DNA純化/回收試劑盒回收各目的基因 片段。在3個滅菌的PCR反應(yīng)管中，分別將各目的基因片段與載體pET-28a雙酶切片段，在 Solution I作用下連接過夜，然后按前述方法進行轉(zhuǎn)化，PCR及酶切檢測，確定目的片段正 確插入。將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，送上海生工生物工程公司測序。 所獲序列用Blast程序與GenBank中己發(fā)表的標準序列進行比較。將鑒定為陽性菌株的重組 克隆命名為ATT-pET28a、TRAP-pET28a、eAl s-pET28a。
[0054] 9、重組蛋白的誘導(dǎo)表達
[0055]將含有 ATT-pET28a、TRAP-pET28a、eAl s-pET28a 的重組質(zhì)粒 BL21 (DE3)表達菌株接 種于含Kan+的50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D6QQ值為0.6時，加入IPTG至終濃度為 lmmo 1/L，繼續(xù)劇烈振蕩培養(yǎng)，在4h取2ml菌液，12000r/min離心lmin，倒掉上清，在沉淀中加 入40yl ddH20，10yl 5XSDS-PAGE loading 13肚€6廣吹打混勻，煮沸5111111，取1(^1在10%的 SDS-PAGE進行電泳分離。電泳后取出凝膠，置于考馬斯亮藍R-250染色液中，在脫色搖床上 染色lh，棄去染色液，用蒸餾水淋洗凝膠后，加入脫色液，在搖床上脫色lh，待藍色背景消 失、目的條帶清晰時，用清水沖洗，照相保存。
[0056] 10、重組蛋白的純化
[0057] 重組細菌培養(yǎng)物生長至A6Q()值為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度ImM/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 4-5h測定誘導(dǎo)菌的A6qq值。然后，用Promega公司的MagneHis?蛋白純化試劑盒進行純化，純 化后蛋白通過SDS-PAGE來進行純度驗證。結(jié)果如圖4所示，通過與白質(zhì)分子量Marker和誘導(dǎo) 〇h相比對，誘導(dǎo)后的目的蛋白大小分別為24KD(ATT)、22KD(TRAP)和18KD(eAls)，與純化后 的目的蛋白大小一致。
[0058] 實施例2
[0059] 本實施例說明ATT、Trap和eAls蛋白免疫效果對比。
[0060] 1、動物免疫和攻毒試驗
[0061 ] 取健康、雌性、相同周齡的SPF級C57/B6小鼠100只，分為S ? aureus Newman和 S. aureus Wood46攻毒組。小鼠ATT蛋白免疫接種后進行攻毒，同時用TRAP蛋白、eALS蛋白、 eAls蛋白與TRAP蛋白混合(eAls+TRAP)和roS作為對照，每組10只。純化各實驗組蛋白lmg/ ml，以1:1的比例與弗式完全佐劑進行乳化，每只200iU小鼠腿部肌肉注射免疫;首次免疫后 21d，將蛋白與不完全弗氏佐劑以1:1比例進行乳化，腿部肌肉注射加強免疫。
[0062] 本實驗取S.aureus Newman，Wood46標準菌株進行攻毒。取稀釋好的菌液對二免后 14d的小鼠腹腔攻毒，并每天記錄小鼠狀態(tài)以及死亡數(shù)目，持續(xù)兩周，無菌狀態(tài)下解剖死亡 小鼠并分離病菌，分析是否為實驗攻毒菌導(dǎo)致小鼠死亡。
[0063]本實驗使用SPF級C57/B6小鼠為模型進行攻毒實驗，具體分組見表2。
[0064] 表2小鼠攻毒模型分組
[0066] 在加強免疫后14d用金黃色葡萄球菌Newman，W〇〇d46菌株以絕對致死量(金黃色葡 萄球菌Newman株以8.0 X 108CFU/mouse和金黃色葡萄球菌Wood46菌株以6.0 X 108CFU/mouse 的劑量)進行小鼠腹腔攻毒，攻毒后觀察實驗小鼠死亡情況并記錄數(shù)據(jù)，見表3。攻毒Newman 株和Wood46株ATT的免疫保護率均為80%。
[0067]表3腔組小鼠模型攻毒結(jié)果
[0070] 2、抗體水平
[0071]用間接ELISA檢測分離的血清樣本中IgG亞類。大量純化實驗組蛋白ATT，TRAP， eAls備用。
[0072] 包被抗原均以10yg/mL濃度，每孔100yL包被96孔酶標板，37 °C兩小時，然后用TOST 洗滌。每孔加1 〇〇此5 %脫脂乳的TOST封閉液，37 °C封閉lh，洗滌;每孔加入PBS稀釋的待檢免 疫血清，37 °C孵育lh，洗滌；每孔加入PBS稀釋的二抗，37 °C孵育lh，洗滌；每孔加入100此 TMB顯色液，室溫顯色lOmin后每孔加入50yL 2M的硫酸終止反應(yīng)，測0D450nm吸光值。分析結(jié) 果。當樣品0D450值M陰性血清的0D450值+3倍標準方差)時即為陽性。
[0073]將各實驗組抗原以lyg/well包被好酶聯(lián)板后，將二免14d血清按1:100比例稀釋作 為一抗，以HRP標記的羊抗鼠 IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3以1:5000稀釋后作為二抗，采用間接 ELI SA方法檢測抗體水平，酶標儀OD45〇下讀取數(shù)值，結(jié)果表明重組蛋白ATT抗體效價最高，高 于Trap及eAls實驗組（圖6)。
[0074] 3、細胞因子檢測
[0075] 用Elispot方法檢測INF-y含量。用ELISA方法檢測IL-4、IL-10、IL-17含量。按細 胞因子檢測試劑盒的操作步驟進行。
[0076] 應(yīng)用ELISP0T方法測定各實驗免疫組和對照組小鼠的淋巴細胞IFN- Y分泌水平 (圖7)。重組蛋白ATT實驗組中INF- y含量高于TRAP實驗組和混合組，差異顯著(P<0.05)， 同其他各組比較差異極顯著(P〈〇.01)。
[0077] 應(yīng)用ELISA方法測定各實驗重組蛋白免疫組和對照免疫組小鼠脾臟細胞上清液中 IL-4、IL-10、IL-17分泌水平（圖8)。所得結(jié)果經(jīng)t-檢驗后，ATT免疫組小鼠脾淋巴細胞上清 液中IL-4、IL-10分泌量高于TRAP實驗組(P<0.01);IL-17A分泌量中，除混合組略高于ATT 組，ATT組與TRAP實驗組比較差異顯著(p〈0.05)，同其他各組比較差異極顯著(P<0.01)。 [0078]以上結(jié)果表明，本發(fā)明ATT融合蛋白疫苗的免疫效果優(yōu)于各蛋白單獨或混合在一 起免疫的免疫效果，是制備金黃色葡萄球菌疫苗理想的候選抗原，即本發(fā)明的融合蛋白具 有更好的免疫原性及免疫保護作用。
[0079]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種ATT融合蛋白，是在金黃色葡萄球菌TRAP融合蛋白的氨基酸序列前用Linker連 接了白色念珠菌Als3T細胞表位的9個氨基酸，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2. 編碼權(quán)利要求1所述的ATT融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。3. 權(quán)利要求1所述的ATT融合蛋白的制備方法，是將權(quán)利要求2中所述的基因克隆至原 核細胞中進行異源表達，純化得融合蛋白。4. 權(quán)利要求1所述的ATT融合蛋白在制備金黃色葡萄球菌疫苗中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種ATT融合蛋白，是在金黃色葡萄球菌TRAP融合蛋白的氨基酸序列前用Linker連接了白色念珠菌Als3T細胞表位的9個氨基酸，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明還涉及編碼ATT融合蛋白的基因、ATT融合蛋白的制備方法以及應(yīng)用。本發(fā)明的ATT融合蛋白免疫接種小鼠，并進行免疫檢測和攻毒試驗，結(jié)果表明ATT融合蛋白能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更堅強的免疫應(yīng)答和抗金黃色葡萄球菌感染作用，是預(yù)防金黃色葡萄球菌感染理想的疫苗候選抗原。
【IPC分類】C12N15/62, C12N15/70, C12R1/19, A61K39/085, C07K19/00, A61P31/04
【公開號】CN105713096
【申請?zhí)枴緾N201610187284
【發(fā)明人】崔玉東, 劉偉, 于立權(quán)
【申請人】黑龍江八一農(nóng)墾大學
【公開日】2016年6月29日
【申請日】2016年3月29日