用于測(cè)定胚胎質(zhì)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明總體上設(shè)及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明設(shè)及用于測(cè)定胚胎質(zhì)量的方 法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，在輔助生殖技術(shù)(ART)中沒(méi)有用于測(cè)定胚胎質(zhì)量的可靠的可商購(gòu)的遺傳或 非遺傳的程序。尤其是，當(dāng)轉(zhuǎn)移至合適的子宮環(huán)境時(shí)，測(cè)定胚胎是否能夠產(chǎn)生存活后代仍然 是一個(gè)重要問(wèn)題。另一個(gè)重要問(wèn)題是測(cè)定將使胎兒W及甚至在孩子存活后發(fā)育的胚胎的基 因譜。
[0003] 選擇具有高移植潛力的胚胎是輔助生殖技術(shù)(ART)中的主要挑戰(zhàn)之一。最初，使用 多胚胎移植(MET)來(lái)使懷孕率最大化。然而，胚胎質(zhì)量的提高和多胎妊娠率的增加造成用于 替代的胚胎數(shù)量減少。因此，選擇"最佳"胚胎成為關(guān)鍵，尤其強(qiáng)烈推薦使用選擇性單胚胎移 植(SET)。因此，需要開(kāi)發(fā)用于胚胎選擇的新的客觀的方法。在IVF和ICSI條件下選擇健康胚 胎的傳統(tǒng)方法基于主觀的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，比如破碎化程度和多核的存在、卵裂球的數(shù)量和大 小、早期胚胎分裂化bner等，2003;Fenwick等，2002)。然而，大多數(shù)研究表明，僅具有合適形 態(tài)學(xué)外觀的胚胎不足W預(yù)測(cè)成功的移植?？紤]到形態(tài)學(xué)評(píng)估和細(xì)胞遺傳學(xué)篩選方法的局限 性，現(xiàn)在朝著更復(fù)雜、高通量的技術(shù)發(fā)展，出現(xiàn)"組學(xué)"科學(xué)，例如轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)。運(yùn)些 方法關(guān)注各種身體細(xì)胞和胚胎培養(yǎng)基。我們的團(tuán)隊(duì)使用卵細(xì)胞(CC)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù) 據(jù)已經(jīng)報(bào)道了用于預(yù)測(cè)胚胎和妊娠結(jié)果的間接且具有吸引力的方法(Assou等，2011 ;Assou 等，2008)。我們觀察到胚胎形態(tài)學(xué)方面和CC基因表達(dá)譜之間沒(méi)有關(guān)系(Assou等，2010)。其 他研究報(bào)道，用Raman或近紅外(NIR)光譜檢測(cè)的舊培養(yǎng)基的代謝譜與個(gè)體胚胎的生殖潛能 相關(guān)(Seli等，2007; Vergow等，2008)。他們還表明，來(lái)自胚胎的培養(yǎng)基的代謝譜與形態(tài)學(xué) 無(wú)關(guān)。
[0004] 移植率降低的另一個(gè)主要原因是移植胚胎的遺傳質(zhì)量差。例如，大多數(shù)胚胎損耗 和損失由非整倍體(染色體數(shù)量異常)造成，所述非整倍體是致死的，且在所有自然流產(chǎn)和 死胎的大約60%中出現(xiàn)。其他遺傳崎形包括染色體非整倍體、擴(kuò)增、易位、插入/缺失、倒位、 短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性、微衛(wèi)星多態(tài)性、單核巧酸多態(tài)性(SNP)和其他結(jié)構(gòu)異常。遺傳崎形 可W導(dǎo)致很多表型疾病，一些甚至是致死的。如果遺傳崎形在胚胎中出現(xiàn)，可能發(fā)生很多類(lèi) 型的產(chǎn)前病癥和先天性疾病。通過(guò)著床前遺傳學(xué)診斷(PGD)篩選運(yùn)些崎形非常重要，W確保 選擇結(jié)構(gòu)上正常的胚胎和存活移植。然而，目前的方法是創(chuàng)傷性的，可能對(duì)胚胎產(chǎn)生損害。
[0005] 據(jù)報(bào)道，在生物液體例如血液、腹水、尿液、羊水、糞便、唾液或腦脊液中可W檢測(cè) 到細(xì)胞游離的DNA。各種核酸，例如DNA、RNA、miRNA實(shí)際上是分離的，并且W細(xì)胞游離的形式 被檢測(cè)到。發(fā)現(xiàn)CfDNA在健康受試者中是可檢測(cè)的量，且在一些病理性疾?。ò┌Y、屯、肌梗 塞、自身免疫性疾病、脈毒癥、創(chuàng)傷……）或特殊生理狀態(tài)(緊張的工作……）中含量更高。 rfDNA的釋放機(jī)制知之甚少，但已經(jīng)表明可能設(shè)及壞死、細(xì)胞調(diào)亡、吞隧作用或主動(dòng)釋放。 WDNA分析是診斷領(lǐng)域中的主動(dòng)研究領(lǐng)域，尤其是兩個(gè)領(lǐng)域目前正經(jīng)歷仔細(xì)審查。然而，還 沒(méi)有研究用于測(cè)定胚胎質(zhì)量的CfDNA檢測(cè)。
[00(?] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0007]本發(fā)明是基于W下重大發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)基中存在一定量的細(xì)胞游離的核酸，其中胚胎 在體外受精條件下生長(zhǎng)。發(fā)明人表明，所述培養(yǎng)基中細(xì)胞游離的核酸的水平為胚胎引起懷 孕的能力提供信息。此外，發(fā)明人表明，分析所述細(xì)胞游離的核酸使得檢測(cè)和表達(dá)特定序列 的基因表達(dá)成為可能，為開(kāi)發(fā)用于胚胎遺傳識(shí)別的無(wú)創(chuàng)方法作鋪墊。
[000引發(fā)明詳述
[0009] 本發(fā)明設(shè)及用于測(cè)定胚胎質(zhì)量的體外無(wú)創(chuàng)方法，包含由W下組成的步驟：i)提供 其中胚胎生長(zhǎng)的培養(yǎng)基樣品，ii)從所述樣品中提取細(xì)胞游離的核酸，和iii)測(cè)定核酸提取 物中所述細(xì)胞游離的核酸的水平和/或測(cè)定核酸提取物中至少一種特定核酸序列的存在 和/或表達(dá)水平。
[0010] 如在本文所用，術(shù)語(yǔ)"胚胎"具有本領(lǐng)域中的通常含義，是指受精的卵母細(xì)胞或受 精卵。術(shù)語(yǔ)"胚胎"還指從受精的卵母細(xì)胞或受精卵發(fā)育直至5或6天(囊胚期）的所有階段中 的細(xì)胞。可W在經(jīng)典的體外受精(ClVF)條件下或在卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)程序下干預(yù) 所述受精。可W通過(guò)本發(fā)明的方法評(píng)估的胚胎的實(shí)例包括1細(xì)胞胚胎(也稱(chēng)為受精卵）、2細(xì) 胞胚胎、3細(xì)胞胚胎、4細(xì)胞胚胎、5細(xì)胞胚胎、6細(xì)胞胚胎、8細(xì)胞胚胎等。通常直到且包括16細(xì) 胞胚胎，其中任何一個(gè)可W通過(guò)任何方便的方式獲得，例如從體內(nèi)已經(jīng)成熟的卵母細(xì)胞或 從體外已經(jīng)成熟的卵母細(xì)胞獲得。如在本文所用，術(shù)語(yǔ)"囊胚"是指在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā) 育中形成的結(jié)構(gòu)，其在桑甚胚形成之后。它具有隨后形成胚胎的內(nèi)細(xì)胞群（ICM)或成胚細(xì) 胞，和之后形成胎盤(pán)的外層細(xì)胞或滋養(yǎng)層。滋養(yǎng)層圍繞內(nèi)細(xì)胞群和稱(chēng)為囊胚腔的充滿(mǎn)液體 的囊胚空腔。人的囊胚包含70-100個(gè)細(xì)胞。人的囊胚形成在受精后5/6天開(kāi)始。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明，卵母細(xì)胞可W來(lái)自ClVF或ICSI的自然周期、改良的自然周期或刺激 周期。術(shù)語(yǔ)"自然周期"是指雌性或女性產(chǎn)生卵母細(xì)胞的自然周期。術(shù)語(yǔ)"改良的自然周期" 是指在用與重組F細(xì)或hMG相關(guān)的Gn畑括抗劑的輕度卵巢刺激下雌性或女性產(chǎn)生一個(gè)或兩 個(gè)卵母細(xì)胞的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)"刺激周期"是指在用與重組FSH或hMG相關(guān)的Gn畑激動(dòng)劑或括抗劑 的刺激下雌性或女性產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)卵母細(xì)胞的過(guò)程。
[0012] 術(shù)語(yǔ)"經(jīng)典的體外受精"或"cIVF"是指在體外卵母細(xì)胞被機(jī)體外部的精子受精的 過(guò)程。當(dāng)體內(nèi)受精失敗時(shí)，IVF是不育的主要治療。術(shù)語(yǔ)"卵胞漿內(nèi)單精子注射"或"icsr是 指其中將單個(gè)精子直接注射如卵母細(xì)胞的體外受精程序。該程序最常用來(lái)克服男性不育因 素，盡管它還可W在當(dāng)卵母細(xì)胞不容易被精子穿透時(shí)使用，偶爾作為體外受精的方法，尤其 是與捐精有關(guān)的方法。
[001引"測(cè)定胚胎質(zhì)量'是指本發(fā)明的方法旨在測(cè)定體夕陵精的情況下，胚胎是否有能力 和/或攜帶遺傳崎形或特定序列。本發(fā)明的方法允許評(píng)估胚胎成功進(jìn)行W下之一或兩者的 能力：賦予高懷孕率和/或產(chǎn)生健康的人。因此，本發(fā)明的方法能夠結(jié)合著床前遺傳學(xué)檢測(cè) 和選擇能引起懷孕的最佳胚胎。
[0014]術(shù)語(yǔ)"有能力的胚胎"（competent emkryo)是指具有導(dǎo)致懷孕的高著床率的胚胎。 術(shù)語(yǔ)"高著床率"是指當(dāng)轉(zhuǎn)移入子宮時(shí)，缺少終止該懷孕的程序或事件的情況下，胚胎在子 宮環(huán)境著床并產(chǎn)生隨后發(fā)育成存活后代的存活胎兒的潛力。
[001引如在本文所用，術(shù)語(yǔ)"遺傳崎形'是指在個(gè)體(例如胚胎)基因組中存在的能引起表 型疾病和致死的任何事件。遺傳崎形包括但不限于非整倍體、易位、基因/位點(diǎn)擴(kuò)增、插入、 缺失、逆轉(zhuǎn)、短串聯(lián)重復(fù)序列（STR)多態(tài)性、微衛(wèi)星多態(tài)性、單核巧酸多態(tài)性(SNP)、引起遺傳 病的單個(gè)基因突變，或其組合。特別地，根據(jù)本方法可W檢測(cè)任何基因遺傳病。例如，基因改 變可W包括在一個(gè)或多個(gè)基因中的已知改變:CFTR、因子VIIKFS基因）、防朱蛋白、血色病、 G6PD，神經(jīng)纖維瘤病、GAPDH、的定粉樣蛋白和丙酬酸激酶。運(yùn)些基因的序列和常見(jiàn)突變(例如 單核巧酸多態(tài)性或SNP)是已知的?？蒞檢測(cè)到其他遺傳崎形，例如設(shè)及在人染色體中缺失 的、W易位或倒位移動(dòng)的、或在染色體復(fù)制中重復(fù)的序列的那些，其中所述序列在胎兒遺傳 物質(zhì)的已知遺傳病中被表征。例如，染色體非整倍體，如唐氏綜合征(21=體）、愛(ài)德華茲綜 合征（18S體）、帕陶氏綜合征（13S體）、特納氏綜合征(45X0)、克氏綜合征(具有2個(gè)X染色 體的男性）、普拉德-威利綜合征和迪格奧爾格綜合征。可W在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中找到已知遺傳 崎形的列表化ttp://omim.o;rg/)。
[0016] 本發(fā)明的方法優(yōu)選應(yīng)用于女性，但理論上也可W應(yīng)用于其他哺乳動(dòng)物（例如靈長(zhǎng) 類(lèi)、狗、貓、豬、牛、鼠……)〇
[0017] 如在本文所用，術(shù)語(yǔ)"核酸"具有本領(lǐng)域的通常含義，是指編碼或非編碼的核酸序 列。核酸包括DNA(脫氧核糖核酸）和RNA(核糖核酸）。因此，核酸的實(shí)例包括但不限于DNA、 mRNA、tRNA、rRNA、tmRNA、mi RNA、P i RNA、snoRNA 和 snRNA。根據(jù)本發(fā)明，核酸可來(lái)源于胚胎的 核或胚胎的線(xiàn)粒體室。"細(xì)胞游離的核酸"是指由胚胎釋放的在培養(yǎng)基中存在的核酸，其中 胚胎在體外受精或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)之后生長(zhǎng)。
[0018] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，當(dāng)胚胎達(dá)到囊胚期(對(duì)應(yīng)于胚胎發(fā)育的第5或6天)時(shí)， 制備樣品?？蒞使用本領(lǐng)域公知的任何方法制備其中胚胎在體外受精或卵胞漿內(nèi)單精子注 射(ICSI)之后生長(zhǎng)的培養(yǎng)基樣品。本發(fā)明的一個(gè)必要特征是，在樣品制備期間，胚胎保持存 活。不使用裂解酶或基于化學(xué)劑的裂解液來(lái)維持胚胎的完整性。本發(fā)明的方法是完美的無(wú) 創(chuàng)方法，其僅基于胚胎能夠在培養(yǎng)基中通過(guò)尚未確定的機(jī)制釋放核酸運(yùn)一事實(shí)。
[0019] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可W使用本領(lǐng)域公知的任何方法從制備的樣品中提取游離的細(xì) 胞核酸。例如，可W使用在實(shí)施例中所述的方法。
[0020] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括由W下組成的步驟：i)測(cè)定核酸提 取物中的核酸水平，ii)將步驟i)中測(cè)定的水平與參考值相比較，和iii)當(dāng)在步驟i)中測(cè)定 的水平低于參考值時(shí)，斷定胚胎是有能力的。
[0021] 可W通過(guò)本領(lǐng)域公知的各種技術(shù)來(lái)測(cè)定核酸水平。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可 W進(jìn)行定量PCR來(lái)測(cè)定DNA水平，例如在El Messaoudi等，2013;Mouliere等，2013 !!"Iiierry 等，2013和W02012/028746中描述的那些。特別地，可W如實(shí)施例所述測(cè)定核酸水平。
[0022] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，參考值是在胚胎發(fā)育第3天在胚胎培養(yǎng)基中測(cè)定的核 酸水平。因此，在培養(yǎng)發(fā)育第3天和第5或6天(囊胚期)之間水平降低表示胚胎是有能力的。
[0023] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，參考值是可W實(shí)驗(yàn)上、經(jīng)驗(yàn)上或理論上確定的闊值或 截止值。也可W基于如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)可的已有的實(shí)驗(yàn)和/或臨床條件任意選擇 闊值。必須確定闊值W獲得根據(jù)試驗(yàn)功能和收益/風(fēng)險(xiǎn)平衡(假陽(yáng)性和假陰性的臨床結(jié)果） 的最佳靈敏性和特異性。通常，可W使用基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的接受器工作特性(ROC)曲線(xiàn)來(lái)測(cè)定 最佳靈敏性和特異性（W及闊值）。優(yōu)選的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W將核酸水平(根據(jù)本發(fā)明的 方法獲得)和確定的闊值相比較。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，闊值來(lái)源于在胚胎培養(yǎng)基中 測(cè)定的核酸水平(或比例，或得分），所述培養(yǎng)基源自正在經(jīng)歷IVF或ISCI的一個(gè)或多個(gè)患 者。此外，在建立運(yùn)些闊值時(shí)也可W使用正在經(jīng)歷IVF或ISCI的患者的適當(dāng)儲(chǔ)存的歷史胚胎 培養(yǎng)基中核酸水平(或比例，或得分)的回顧性測(cè)量。
[0024] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括由W下組成的步驟：i)檢測(cè)核酸提 取物中的至少一個(gè)突變，和ii)當(dāng)檢測(cè)到突變時(shí)，斷定胚胎攜帶遺傳崎形。
[0025] 用于檢測(cè)核酸，尤其是DNA或mRNA中的突變的一般技術(shù)包括但不限于限制性片段 長(zhǎng)度多態(tài)性、雜交技術(shù)、測(cè)序、外切酶抗